A muricholikus epesavakban bővelkedő egerek ellenállnak az étrend által kiváltott steatosisnak, a súlygyarapodásnak és a csökkent glükózanyagcserének.

Karolinska Intézet, Karolinska Egyetemi Kórház Huddinge, Stockholm, Svédország, Biotudományok és Táplálkozás Tanszék, Karolinska Intézet, Karolinska Egyetemi Kórház Huddinge, Stockholm, Svédország

Huddinge Karolinska Egyetemi Kórház, Karolinska Intézet, Laboratóriumi Orvostudományi Osztály, Stockholm, Svédország

Ylva Bonde,
Gösta Eggertsen,
Mats Rudling

Ábrák

Absztrakt

A muricholikus epesavak magas endogén termelése vagy kezelése erősen csökkenti a koleszterin felszívódását. A muricholikus epesavakban bővelkedő egerek ezért fokozott ellenállást mutathatnak az étrend által kiváltott súlygyarapodás, steatosis és glükóz-intolerancia ellen a lipid felszívódás várható általános csökkenése miatt. Ennek a hipotézisnek a teszteléséhez a szteroid-12-alfa-hidroxilázban (Cyp8b1 -/-) hiányos egereket, ezért bőségesen a muricholsavakban, 11 héten keresztül követtük nyomon magas zsírtartalmú étrend mellett. Meghatározták a táplálékfelvételt, a test és a máj súlyát, valamint a májban, a szérumban és a székletben lévő lipideket. Továbbá értékelték az orális glükóz- és intraperitoneális inzulin tolerancia tesztek során kapott válaszokat.

A magas zsírtartalmú étrenden a Cyp8b1 -/- egerek kevesebb súlygyarapodást mutattak, mint a vad típusú alomtársak (Cyp8b1 +/+). Ezenkívül a zsírszegény étrendben lévő Cyp8b1 -/- egerekben a steatosisos májnagyobbodás és a szérum LDL-koleszterinszint emelkedése erősen gyengült. A koleszterin ürülékkel történő kiválasztása fokozódott, és erős tendencia volt a szabad zsírsavak kétszerese ürülékében, míg a trigliceridek kiválasztása nem változott, ami a csillapított lipidfelszívódást jelzi. Magas zsírtartalmú étrend mellett a Cyp8b1 -/- egerek alacsonyabb szérum glükózszintet mutattak orális glükózszondával vagy intraperitoneális inzulininjekcióval szemben, összehasonlítva a Cyp8b1 + /+ .

Összefoglalva, a magas zsírtartalmú étrendnek való kitettséget követően a Cyp8b1 -/- egerek jobban ellenállnak a súlygyarapodásnak, a steatosisnak és a glükóz intoleranciának, mint a Cyp8b1 +/+ egerek. A csökkent lipidfelszívódás részben magyarázhatja ezeket a megállapításokat. Összességében az eredmények arra utalnak, hogy a muricholikus epesavak hasznosak lehetnek a metabolikus szindróma ellen.

Idézet: Bonde Y, Eggertsen G, Rudling M (2016) A muricholikus epesavakban bővelkedő egerek ellenállnak az étrend által kiváltott steatosisnak, a súlygyarapodásnak és a csökkent glükózanyagcserének. PLoS ONE 11 (1): e0147772. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0147772

Szerkesztő: Jonathan Peterson, Kelet-Tennessee Állami Egyetem, EGYESÜLT ÁLLAMOK

Fogadott: 2015. október 14 .; Elfogadott: 2016. január 7 .; Közzétett: 2016. január 29

Adatok elérhetősége: Minden lényeges adat a cikkben található.

Finanszírozás: Ezt a munkát a http://www.vr.se, Grant no. K2013-55X-15075-10-3, http://www.hjart-lungfonden.se, támogatás sz. 20130518, http://www.diabetes.se/diabetesfonden, Grant sz. DIA 2014-064, http://www.cardiovascular.se, támogatás sz. Nem alkalmazható, és http://www.sll.se/, támogatás száma. 20130327. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmány tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

Anyagok és metódusok

Állatok

Ebben a vizsgálatban 10–11 hónapos Cyp8b1 -/- egereket és Cyp8b1 +/+ alomtársaikat használtuk, a fentiek szerint beltenyésztve [6]. Összesen 73 egeret osztottak a következő csoportokba; Cyp8b1 +/+ egerek rendszeres egér-chow-t etettek (wt chow; 8 nőstény és 10 hím), Cyp8b1 -/- egerek rendszeres egér-chow-t (ko chow; 10 nőstény és 9 hím), Cyp8b1 +/+ egerek HFD-t (wt HFD; 8 nőstény és 10 hím) és CFP8b1 -/- egerek, amelyek HFD-vel táplálkoztak (ko HFD; 9 nőstény és 9 hím). A HFD-t a Research Diets Inc.-től (D12492, New Brunswick, NJ) szereztük be, és 60 kcal% zsírt tartalmazott. A szokásos egér-chow (RM3 (P), Special Diet Services, Scanbur, Stockholm, Svédország) 11 kcal% zsírt tartalmazott. Az egereket szabályozott hőmérsékletű, kórokozóktól mentes környezetben tartottuk, 12 órás világos-sötét ciklusban, táplálékkal és vízzel ad libitum. A testtömeget (egyedi mérések) és a táplálékfelvételt (csoportonként) hetente ellenőriztük.

Állati eljárások

9 hét elteltével orális glükóz tolerancia tesztet (OGTT) hajtottak végre 4 óra éhgyomri egereken, szájon át adott glükózzal (1 g glükóz/ttkg, G8769, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). 10 hét után intraperitoneális inzulin tolerancia tesztet (IITT) hajtottak végre 4 óra éhgyomri egereken intraperitoneális inzulin injekciók beadásával (0,75 U inzulin/testtömeg-kg, Actrapid Penfill, Novo Nordisk, Bagsvaerd, Dánia). A vércukorszintet a farok hegyéből vett vérmintákban határoztuk meg, mielőtt glükózt vagy inzulint adtunk volna (0 percnél), majd ismét beadás után 15, 30, 60 és 130 perccel, majd ACCU-CHEK Aviva és teszt segítségével elemeztük. csíkok (Roche, Mannheim, Németország). 11 hetes kezelés után 4 órán át éheztetett egerekből vért gyűjtöttünk szívpunkcióval az izofluránnal végzett érzéstelenítés során, majd az érzéstelenített egereket méhnyak diszlokációval feláldoztuk. Az összegyűjtött szerveket megmérjük és folyékony nitrogénben gyorsfagyasztjuk. A stockholmi déli etikai bizottság jóváhagyta ezt a kutatást (jóváhagyási szám: S96-11).

A máj teljes koleszterinszintje

A máj teljes koleszterinszintjét 20% homogenátumban határozzuk meg, amelyet 0,3 g májból állítunk elő egyénenként. 1 ml kloroform: metanol 2: 1 arányú elegyét és 0,1 ml 0,9% -os nátrium-klorid-oldatot adtunk 20 μl homogenátumhoz, két ismétlésben, amelyeket vortexben forgattunk, majd szobahőmérsékleten 1 órán át hagytuk szétválni. Az alsó fázist összegyűjtöttük és 60 ° C-ra helyeztük folyékony nitrogénáram alatt, hogy elpárologjon, majd újra feloldottuk 1 ml kloroform: metanol 2: 1 arányú elegyében, amelyből 0,5 ml-t összegyűjtöttünk, bepároltunk és 1 ml 0,5 mol/l koncentrációban. kálium-hidroxid etanolban hozzáadva, mielőtt a mintákat 70 ° C-ra helyezték 90 percre, hogy újra feloldódjanak. Ezután 1 ml vizet és 5 ml hexánt adunk hozzá, és a mintákat erőteljesen rázzuk, mielőtt szobahőmérsékleten 1 órán át elválasztanánk. A felső fázist összegyűjtöttük, és 60 ° C-ra helyeztük folyékony nitrogénáram alatt, hogy elpárologjon, majd piridin/hexametil-diszilazán/klór-trimetil-szilán (3: 2: 1, v/v/v) szililezés előtt betöményítettük, majd újra feloldottuk. 0,1 ml hexán. A mintákat gázkromatográfia-tömegspektrometriával elemeztük, belső standardként 2H7-koleszterint használva. A máj összes koleszterintartalmát kiszámítottuk egyénenként úgy, hogy megszoroztuk a koleszterin koncentrációt a máj tömegével.

A máj teljes TG-je

A máj teljes TG-szintjét 0,2 g máj homogenátumaiban 4 ml kloroform: metanol 2: 1 arányú elegyében vizsgáltuk egyenként. A homogenizátumokat 3500 fordulat/perc sebességgel 10 percig szobahőmérsékleten centrifugáltuk. 2 ml felülúszót összegyűjtöttünk és 0,8 ml 0,9% -os nátrium-kloridot adtunk hozzá, mielőtt a mintákat szobahőmérsékleten 10 percig 3500 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk. Az alsó fázis 0,6 ml-ét két példányban összegyűjtöttük és bepároltuk, mielőtt 0,6 ml metanolt adtunk volna 0,05% -os Tween 80-mal, majd vortexeltük. A mintákat ultrahanggal kezeltük, 50 ° C-ra helyeztük, és feloldásig vortexeltük. A minták elemzéséhez a gyártó utasításai szerint Tecan Infinite® M200 olvasót (Männedorf, Svájc) és a Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Németország) reagenseit használtuk. A máj összes TG-tartalmát kiszámoltuk egyénenként úgy, hogy megszoroztuk a koleszterin koncentrációt a máj tömegével.

Lipoprotein koleszterin

A lipoprotein-koleszterint a VLDL, az LDL és a HDL lipoprotein frakcióiban gyors teljesítményű folyadékkromatográfiával [13] mértük a Roche Diagnostics GmbH reagenseivel.

Szérum kampeszterin

A szérum kampeszterin szintjét duplikált mintákban határoztuk meg gázkromatográfia-tömegspektrometriával a leírás szerint [14], és a szérum koleszterinszintre normalizáltuk. Ez a növényi szterin a koleszterin felszívódásának indirekt markerként szolgál [15].

Széklet szabad zsírsavak, koleszterin és trigliceridek

Összes glükagonszerű peptid-1 (GLP-1)

Az összes glukagon-szerű peptid-1 (GLP-1) szintet duplikált szérum alikvotokban vizsgáltuk elektrokemilumineszcencia immunanalízissel a gyártói irányelvek szerint (K150JVC-2, Meso Scale Discovery (MSD), Gaithersburg, MD) SECTOR Imager 6000 alkalmazásával. eszköz (MSD).

statisztikai elemzések

Az adatok az átlag ± standard hiba (SEM) értékét mutatják. A csoportok közötti különbségek jelentőségét egyutas ANOVA-val, majd Tukey tesztje szerinti post-hoc összehasonlításokkal teszteltük, a GraphPad Prism szoftver (GraphPad Software Inc. San Diego, CA) felhasználásával. A csoportok közötti különbségek jelentőségét a széklet lipid kiválasztása tekintetében t-teszttel teszteltük.

Eredmények

A HFD-n lévő Cyp8b1 -/- egerek fokozott védelmet mutatnak a glükóz intolerancia ellen

9 hetes chow-val vagy HFD-vel történő etetés után az OGTT (1A. Ábra) azt mutatta, hogy a cow-vel táplált Cyp8b1 +/+ és Cyp8b1 -/- egerek ugyanolyan toleránsak a glükózzal szemben, bár az 1B. Ábra görbe alatti területe (AUC), bár a Cyp8b1 -/- egerekben alacsonyabb glükózszint alakult ki. A HFD-vel táplált Cyp8b1 +/+ és Cyp8b1 -/- egerekben a glükóz tolerancia romlott, összehasonlítva a megfelelő chow táplált kontrollokkal. Ez a károsodás azonban szignifikánsan kevésbé volt súlyos a Cyp8b1 -/- egerekben, összehasonlítva a Cyp8b1 +/+ egerekkel. A 10 hetes kezelés után elvégzett IITT (1C. Ábra) azt mutatta, hogy a chow-vel táplált Cyp8b1 +/+ és Cyp8b1 -/- egerek ugyanolyan jól reagálnak az inzulinra, amelyet az AD ábrán mutatunk be az 1D. A Cyp8b1 +/+ táplált HFD-vel az inzulinra adott válaszreakció romlott, összehasonlítva a chow-táplált kontrolljával, míg a HFD-vel táplált Cyp8b1 -/- egerekben az inzulinra adott válasz nem különbözött a Chow-táplált kontrolltól.

Vércukorszint az orális glükóztolerancia teszt (OGTT) eredményeként (A) és a görbék alatti terület (AUC) (B). Vércukorszint az intraperitoneális inzulin tolerancia tesztre (IITT) válaszul (C), és AUC-ként (D). Az adatokat átlag ± SEM-ként mutatjuk be, n = 16 az összes csoportra. *** = p -/- a HFD-vel táplált egerek védettek a hepatomegalia és a steatosis ellen, és javított lipoprotein profilokat mutatnak

A máj súlyában nem volt különbség a cyp8b1 +/+ és a cyp8b1 -/- egerek között, akiket etettek chow-val (2A. Ábra). A HFD-vel táplált Cyp8b1 +/+ egerekben a máj súlya 43% -kal nőtt, míg a HFD-vel táplált Cyp8b1 -/- egerekben a máj súlya nem változott. A máj súlyának összehasonlítása a HFD-vel táplált Cyp8b1 +/+ és Cyp8b1 -/- egerek között azt mutatta, hogy az utóbbiak májja 29% -kal könnyebb.

Májsúly (A), máj koleszterin (B) és máj-trigliceridek (TG-k) (C). Szérum koleszterin a VLDL-ben (C), LDL (D), és HDL (E) lipoprotein frakciók. Az adatokat átlag ± SEM-ként mutatjuk be, n = (18–19) az összes csoportra. *** = p +/+ és Cyp8b1 -/- egerekkel táplálták a chow-t (2B. és 2C. ábra). A HFD-vel táplált Cyp8b1 +/+ egerekben a koleszterin- és TG-tartalom 43% -kal, illetve 36% -kal nőtt, míg a HFD-vel táplált Cyp8b1 -/- egerekben változatlan volt, összehasonlítva a megfelelő chow-táplált kontrollokkal. Valójában a HFD-n lévő Cyp8b1 -/- egerek 25% -kal alacsonyabb koleszterinszintet és 27% -kal alacsonyabb TG-tartalmat tartalmaztak, mint a HFD-n lévő Cyp8b1 +/+ egerek. A szérum LDL- és HDL-koleszterinszintek nem különböztek a chow-val táplált Cyp8b1 +/+ és Cyp8b1 -/- egerek között, míg a bazális VLDL-koleszterinszint 36% -kal alacsonyabb volt a Cyp8b1 -/- egerekben (2D – 2F. Ábra). A HFD-n lévő Cyp8b1 +/+ egerekben az LDL- és a HDL-koleszterinszint 225% -kal, míg a HDL-koleszterinszint 71% -kal nőtt, összehasonlítva a chow-táplált kontrollval. A HFD-n lévő Cyp8b1 -/- egerekben is az LDL- és a HDL-koleszterinszint 87% -kal, illetve 71% -kal nőtt, összehasonlítva a chow-táplált kontrollal. Azonban az LDL-koleszterin a HFD-n lévő Cyp8b1 -/- egerekben 35% -kal alacsonyabb volt, mint a HFD-s Cyp8b1 +/+ egerekben, míg a HDL-koleszterin szint hasonló volt.

A HFD-s Cyp8b1 -/- egerekben csökken a testtömeg-növekedés és az élelmiszer-hatékonyság

A testsúly nem különbözött a Cyp8b1 +/+ és a Cyp8b1 -/- egerek között a csirkén a kísérlet során (3A és 3B. Ábra), bár a Cyp8b1 -/- erőteljes tendenciát mutatott, hogy könnyebb legyen. Jelentősen megnövekedett testsúlyt találtak mind a Cyp8b1 +/+, mind a Cyp8b1 -/- egerekben, akiket HFD-vel tápláltak, de a testsúlygyarapodás 30% -kal kisebb volt a Cyp8b1 -/- egereknél, mint a Cyp8b1 +/+ egereknél, mint a 3C. Ábra mutatja. A táplálékbevitel hasonló volt a chow-táplált Cyp8b1 +/+ és Cyp8b1 -/- egereknél, valamint a CF8b1 +/+ és a Cyp8b1 -/- egereknél HFD-n (3D ábra). A HFD jelentősen csökkentette az elfogyasztott élelmiszer mennyiségét, de a teljes kalóriabevitel számításai azt mutatták, hogy a kalóriabevitel hasonló volt a chow-táplált kontrollokéhoz. A testtömeg-növekedés átlagos AUC-jának és a táplálékfelvétel átlagos AUC-jának (az élelmiszer-hatékonyságra utalva, 3E. Ábra) alapján azt jeleztük, hogy a HFD-n lévő Cyp8b1 -/- egerek kevésbé hatékonyan használták fel az elfogyasztott ételt a testtömeg növelésére, mint a Cyp8b1 +/+ egerek HFD-n.

Testsúly (A) és a görbe alatti terület (AUC) (B). A nyíl azt az időpontot jelöli, amikor a HFD-n lévő Cyp8b1 -/- és Cyp8b1 +/+ egerek között jelentős testtömeg-különbség jelentkezett először, és ez a különbség a kísérlet során is fennmaradt. A testtömeg-növekedés AUC-ként jelenik meg (C), táplálékbevitel (D) és az élelmiszer-hatékonyság (E). Ahol megjelöltük, az adatokat átlag ± SEM-ként mutatjuk be, n = (17–19) az összes csoportra. *** = p -/- egerek

A fekális koleszterin kiválasztása egerekben HFD-vel több mint kétszeresére nőtt a Cyp8b1 -/- egerekben, összehasonlítva a Cyp8b1 +/+ egerekével (4A. Ábra). Ezzel összhangban a bél koleszterin felszívódásának értékelésére általánosan használt kampeszterin szérumszintek erősen csökkentek a HFD-n lévő Cyp8b1 -/- egereknél, a szintek a kimutatási határ alatt voltak (4B. Ábra). A FFA-k székletürítése szintén megduplázódott a Cyp8b1 -/- egerekben HFD-n, bár nem érte el a statisztikai szignifikanciát. A TG-k ürülékének kiválasztása nem változott a HFD-n lévő Cyp8b1 -/- egerekben, összehasonlítva a HFD-n lévő Cyp8b1 +/+ egerekkel.

FFA-k, koleszterin és trigliceridek ürülékkel történő kiválasztása (A), a szérum kampeszterinszintje, a koleszterin felszívódásának markere (B), és a szérum glükagonszerű peptid-1 (GLP-1) szintje (C). Ahol jelezték, az adatokat átlag ± SEM-ként mutatják, n = (17–19) az összes csoportra. *** = p -/- egerek (4C. ábra). A HFD-n a GLP-1 szintje 37% -kal csökkent a Cyp8b1 -/- egerekben, és a Cyp8b1 +/+ egereknél is erős tendencia volt a csökkent GLP-1 szint csökkentésére.

Vita

Számos egér modell, amelyek rezisztensek az étrend által kiváltott glükóz intoleranciára [9–12], megosztják a fenotípusos tulajdonságokat a Cyp8b1 -/- egerekkel, pl. egy megnövelt, MCA-kkal dúsított BA medence [3, 8]. Feltételeztük, hogy az MCA magas szintje fontos lehet a káros glükóz metabolizmus elleni rezisztencia szempontjából, és ezért a Cyp8b1 -/- egereknek ellenállóaknak kell lenniük a glükóz intoleranciával szemben is. A vizsgálatokat nőkön és férfiakon egyaránt elvégezték, és az eredmények az összesített adatokon alapulnak, miközben külön elemzés után is fennmaradtak. A nők és a férfiak adatait külön-külön az 1. és a 2. táblázat tartalmazza. Megjegyzendő, hogy a HFD-re adott egyes válaszok még kifejezettebbek voltak a férfiaknál, pl. válasz az IITT-re, a máj súlya és a máj triglicerid tartalma.

Ez a tanulmány azt mutatja, hogy a Cyp8b1 -/- egereknek jobb ellenállóképességük van az étrend által kiváltott súlygyarapodással és a káros glükóz-anyagcserével szemben, amikor HFD-vel kezelik őket, amint azt az OGTT és az IITT nyomán bekövetkezett javult vércukorszint mutatja (1A – 1D. Ábra). Ugyanakkor nem voltak különbségek az éhomi vércukorszintekben a cyp8b1 +/+ és a Cyp8b1 -/- egerek között, bár a chow-n lévő Cyp8b1 -/- egerekben állandó tendencia volt az alacsonyabb vércukorszintre. Ezenkívül a HFD-n lévő Cyp8b1 -/- egerek rendkívül javított rezisztenciát mutatnak a máj megnagyobbodásával szemben, azzal a megállapítással összhangban, hogy nem halmoztak fel koleszterint vagy TG-ket a májukban, mint a HFD-n lévő Cyp8b1 +/+ egerek (2A – 2C. Ábra). Nem világos annak oka, hogy a máj megnagyobbodása miért nem következett be a Cyp8b1 -/- egerekben. Ez magában foglalhatja az étkezési zsír felszívódásának általános csökkenését, de a kolinsav hiánya és az FXR antagonista MCA-k magas mennyisége [16] is szerepet játszhat, míg ez a két feltétel csökkenti az FGF15 expresszióját [17, 18]. A normális FGF15 expresszióról a máj regenerációja szempontjából döntő jelentőségű [19].

Azt javasolták, hogy a csíra mentes egerek miért rezisztensek a glükóz intolerancia kialakulására a mikrobiota hiányához. A jelenlegi eredmények azt mutatják, hogy a Cyp8b1 -/- egerek is ellenállnak a glükóz intoleranciának, arra utalnak, hogy a mikrobiota hiánya önmagában nem lehet kulcsfontosságú, támogatva annak lehetőségét, hogy a megváltozott BA szint és összetétel fontos lehet, mivel a BA-k szabályozzák a mikrobiotát [ 22]. A Cyp8b1 -/- egerek mikrobiális összetételének értékelése tehát egy másik szempont, amelyet a jövőbeni vizsgálatokba be kell vonni.

Összefoglalva, ezek a megállapítások azt mutatják, hogy az MCA-kban gazdag BA-medencével rendelkező Cyp8b1 -/- egerek védettek a metabolikus szindróma számos stigmájának, például a test és a máj súlygyarapodása, steatosis, hiperkoleszterinémia és inzulinrezisztencia kialakulása ellen. Az eredmények azt mutatják, hogy az MCA-k terápiás potenciállal bírhatnak a metabolikus szindróma kezelésében.

Köszönetnyilvánítás

Köszönetet mondunk Ingela Arvidssonnak és Lisbet Benthinnek, a Huddinge Karolinska Egyetemi Kórháznak a szakértői technikai segítségért, és Matti Jauhianennek, a Helsinki Egyetemnek, a széklet lipidek elemzésével kapcsolatos kedves tanácsokért.

Szerző közreműködései

A kísérletek megtervezése és megtervezése: YB MR. Végezte a kísérleteket: YB. Elemezte az adatokat: YB GE MR. Hozzájáruló reagensek/anyagok/elemző eszközök: YB GE MR. Írta az írást: YB GE MR.