Oxidatív stressz, amely szerepet játszik a tengeri uborka szerkezeti változásaiban Stichopus japonicus testfal alacsony hőmérsékletű kezelés során

Eredeti cikk

Teljes cikk
Ábrák és adatok
Hivatkozások
Idézetek
Metrikák
Engedélyezés
Újranyomtatások és engedélyek
PDF

ABSZTRAKT

Bevezetés

A tengeri uborka tüskésbőrű és magas kereskedelmi értéke miatt Kínában és más ázsiai országokban az egyik fontos tenyésztett vízi faj. [1] A tengeri uborka teljes világtermelése 2013-ban körülbelül 232 000 tonna volt (FAO). Stichopus japonicus (S. japonicus) több mint 20 ehető tengeri uborka gazdaságilag legfontosabb faja Kínában. [2] Nehéz fenntartani a S. japonicus a rendszeres termikus feldolgozás során a S. japonicus testfal (SJBW), amely befolyásolja a texturális tulajdonságait, ami súlyos gazdasági veszteségeket okoz a tenger gyümölcseinek iparban. [3, 4] Ezért nagyon fontos megérteni azokat a paramétereket, amelyek szabályozzák az SJBW texturális megváltoztatását a hőkezelés során, és hogyan lehet javítani annak minőségét a feldolgozás során.

Legjobb tudomásunk szerint az SJBW fűtési folyamatához a legtöbb tanulmány a minőség értékelésére kényszerült különféle technikákkal, [2, 14], de keveset tudunk arról, hogy a textúra miért változott, és hogy az oxidatív stressz indukálta-e a jelenséget. Ezért ennek a tanulmánynak az volt a célja, hogy tovább vizsgálja az ROS és azok downstream jelátviteli fehérjéinek és enzimeinek az SJBW textúrájára gyakorolt lehetséges hatásait, és feltárja az SJBW alacsony hőmérsékletű kezelés alatti texturális változásainak mechanizmusát, amely fényt derít a hogyan lehet tovább javítani az SJBW magas minőségének fenntartásához szükséges hőkezelési folyamatokat.

Anyagok és metódusok

Anyagok és vegyszerek

Élő S. japonicus (150 ± 20 g) egy helyi vízi piacról vásárolt Dalianban (Kína). Szarvasmarha szérum albumin (BSA), N, N, N, N-tetrametil-etilén-diamint (TEMED), nátrium-dodecil-szulfátot (SDS), ditiotreitolt (DTT) és Coomassie ragyogó kék R-250-et a Sangon Biotech Co., Ltd-től (Sanghaj, Kína) szereztünk be. A fenil-metánszulfonil-fluoridot (PMSF) és az etilén-diamin-tetraacetátot (EDTA) a Sigma Chemical cégtől (St. Louis, MO) szereztük be. A Caspase-3 aktivitás készletet a Beyotime Biotechnológiai Intézetből (Haimen, Kína) szereztük be. A Cathepsin L szubsztrátumot a Santa Cruz Biotechnology-tól (Sanghaj, Kína) szerezték be. Az ebben a vizsgálatban használt összes többi vegyi anyag analitikai minőségű volt.

Alacsony hőmérsékletű kezelés

A zsigereket és a fejeket eltávolítottuk a friss tengeri uborkákról. A testfalakat 3–5 egyedet tartalmazó Petri-csészékre helyeztük, és HH3 elektrotermosztatikus vízfürdőben (Changzhou Zhongbei Instrument Co., LTD, Jiangsu, Kína) tartottuk 37 ° C-on 1/6, 1/2, 1, 3, 6, 12, 24 és 36 óra. A mintákat periodikusan elemeztük, hogy rögzítsük morfológiai változásaikat. A tengeri uborkákat folyékony nitrogénben fagyasztották kontroll mintaként, a testfalak pedig fűtés nélkül voltak a 0 órás minták. Az összes testfalat és a kontrollmintákat ezután -80 ° C-on tároltuk a további kísérletekhez.

Oldható kollagéntartalom meghatározása

Tíz gramm SJBW-t szuszpendáltunk 10 ml ultratiszta vízben, majd 2 órán át 80 ° C-os vízfürdőbe helyeztük, miközben 30 percenként folyamatosan rázattuk. 2 óra múlva a mintákat 30 percig 1500xg sebességgel centrifugáltuk. Az oldható kollagéntartalom meghatározása a Starkey és munkatársai által leírt AOAC 990.26 módszer szerint történt. [15] Az eredményeket mg/g SJBW-ben fejeztük ki.

Instrumentális textúra elemzés

A keménység és a rághatóság értékeit P/0,5 szondával felszerelt TA-XT2i textúra-analizátorral (Stable Micro Systems, Surrey, Egyesült Királyság) határoztuk meg. A mintákat elemzés céljából 1,5 × 1,5 × 1,5 cm-es kockákra vágtuk. Mindegyik minta két kompressziós elemzési cikluson esett át, 70% -os tömörítési szinttel (a minta szélességéhez viszonyítva, 1 mm/s keresztfej sebességhez viszonyítva), 5 másodperces relaxációs idővel a két ciklus között, Bourne és az SMS kézikönyv szerint (Stable Micro Systems, Surrey, Egyesült Királyság). [16]

A fehérjebontás értékelése

A fehérjebomlást nátrium-dodecil-szulfát – poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS – PAGE) elemeztük, 5% -os halmozó géllel és 10% -os futó géllel. A mintákat fehérje extrakciós oldattal (20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 10 mM DTT, 1% Trition X-100, 0,1% SDS) őröltük 1: 3 (w/v) arányban. ) jégen. Az extraktumokat ezután 12 000 x g-vel 15 percig, 4 ° C-on centrifugáltuk, és a felülúszókat SDS-PAGE mintapufferrel (0,25 M Tris-HCl (pH 7,5), 8 M karbamid, 5% SDS, 5%) kevertük. merkaptoetanol) 4: 1 arányban, és 5 percig forraljuk. Az elforgatott mintákat (10 μg) és a markereket a rakó gélben lévő mintatérekbe töltöttük, és Mini Protein rendszer segítségével elemeztük (Bio-Rad Laboratories, Berkeley, Kalifornia, USA). Szétválasztás és 0,05% Coomassie Brilliant Blue R-250 festés után, majd 30% metanollal és 10% ecetsavval végzett festés után.

A CL aktivitás mérése

A mintákat fehérje-extrakciós oldattal (50 mM foszfátpuffer (pH 7,0), 0,1% Triton X-100, 1 mM EDTA) homogenizáltuk 4 ° C-on 1: 3 (w/v) használt üvegcsiszolókkal. A homogenizátumokat ezután 9600xg sebességgel 10 percig 4 ° C-on centrifugáltuk Legend Micro 17R centrifugával (Thermo Fisher Scientific, New York, USA), a felülúszókat összegyűjtöttük a CL aktivitás elemzéséhez. A CL aktivitását Qi és mtsai. [4] A CL-aktivitás meghatározásához szubsztrátként Z-Phe-Arg-Mec-et használtunk. A CL aktivitását U/mg fehérje értékben fejeztük ki.

A DNS-fragmentáció értékelése

Különböző időkben kezelt SJBW mintákat gyűjtöttünk, és DNS-t nyertünk Miyoshi és mtsai. [17] A kivont DNS-mintákat elektroforézissel megvizsgáltuk 2,0% agarózgélben; majd a géleket gélvörös színnel festettük és UV-rendszerrel képalkotóvá alakítottuk (Bio-Rad Laboratories, Berkeley, Kalifornia, USA).

A kaszpáz-3 aktivitás mérése

Az SJBW mintákat lízispufferrel (25 mM HEPES (pH 7,4), 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 μM Pepstatin, 1 mM PMSF) homogenizáltuk, és a lizátumokat 9600 × g sebességgel centrifugáltuk. 10 percig 4 ° C-on. A felülúszókat ezután inkubáltuk kaszpáz-3 szubsztráttal acetil-Asp-Glu-Val-Asp o-nitroanilid (Ac-DEVD-oNA) 30 percig 37 ° C-on, és az abszorbanciát 405 nm-nél leolvastuk. Az aktivitási vizsgálatokban használt felülúszók fehérjekoncentrációját Bradford-esszével határoztuk meg. [18] A kezelt mintákban meghatározott kaszpáz-3 aktivitást a kontroll csoporthoz viszonyított relatív növekedéssel fejeztük ki.

Western blottolás

Az SJBW mintáit lízispufferben (20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 2 mM EGTA, 2 mM EDTA, 10 mM DTT, 10 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 0,1% SDS, 1) lizáltuk. % Trion X-100, 10 μg/ml leupeptin, 10 μg/ml aprotinin, 1 mM PMSF) jégen. A lizátumokat 10 000 x g-vel 15 percig, 4 ° C-on centrifugáltuk, és a felülúszókat összegyűjtöttük. Az összes fehérjét Bradford módszerrel számszerűsítettük. A felülúszókat SDS-PAGE mintapufferrel 4: 1 arányban összekevertük és 5 percig forraltuk. Ezután 20 μg fehérjét 10% SDS-PAGE-nak vetünk alá, és az összes fehérjét polivinilidén-difluorid (PVDF) membránokba (Millipore, Billerica, Massachusetts, USA) vittük át. A membránokat blokkoltuk, majd anti-p-p38 (1: 1000 hígítás), anti-p-ERK1/2 (1: 2000 hígítás), anti-p-JNK (1: 1000 hígítás) és anti-β- aktin antitest (1: 1000 hígítás) egy éjszakán át 4 ° C-on, majd a másodlagos antitest. A fehérjéket fokozott kemilumineszcencia (ECL) reagenssel detektáltuk. A filmeket a Chemi Doc rendszer (Bio-Rad Laboratories, Berkeley, Kalifornia, USA) szkennelte és elemezte.

ROS mérés

Az SJBW mintákat közvetlenül liofilizáltuk, elektron spin-rezonancia (ESR) spin-csapdázási mérésnek vetettük alá. Röviden: 20 mg liofilizált port helyezünk egy üveg kapilláris csőbe, és az ESR üregébe helyezzük. Az ESR spektrumokat ESR spektrométerrel (Bruker A200, Karisruhe, Németország) vettük fel szobahőmérsékleten, a következő beállításokkal: mikrohullámú teljesítmény 6,10 mw, söpörési szélesség 200,00 Gauss, középtér 3460,00 Gauss, modulációs frekvencia 100,00 kHz, modulációs amplitúdó 1,00 gauss, időállandó 5242,88 ms és konverziós idő 480,00 ms.

Statisztikai analízis

Az összes adatot az SPSS 16.0 (SPSS Inc., 2001, Chicago, IL, USA) és az egyfaktoros varianciaanalízissel (ANOVA) elemeztük. Az összes vizsgálathoz három külön kísérletet hajtottunk végre. Az átlag ± SE-t kiszámítottuk. Az átlagok közötti különbségeket szignifikánsnak ítélték a p A tengeri uborka textúraváltozásaiban szerepet játszó oxidatív stressz Stichopus japonicus testfal alacsony hőmérsékletű kezelés során

Online közzététel:

1. ábra Az SJBW morfológiájának és textúrájának változásai alacsony hőmérsékletű, 37 ° C-os kezelés során. a) a morfológiai megfigyelés; b) az SJBW oldható kollagénje 37 ° C-on, különböző elemzett időkig. A kontroll volt a friss minta. Az eredmény három független kísérletet reprezentatív; c) az SJBW keménységének változása 37 ° C-on, különböző ideig; d) az SJBW rághatóságának változása 37 ° C-on, különböző időtartamokra. A különböző betűk szignifikáns különbségeket jeleznek (p 1. ábra. Az SJBW morfológiájának és textúrájának változásai 37 ° C-on történő alacsony hőmérsékletű kezelés során. A) Morfológiai megfigyelés; b) SJBW oldható kollagén 37 ° C-on, különböző elemzett időkben. A kontroll a friss minta volt. Az eredmény három független kísérlet reprezentatív; c) az SJBW keménységének változása 37 ° C-on, különböző időtartamra; d) az SJBW rágóképességének változása 37 ° C-on, különböző időtartamokra. A különböző betűk jelentős különbségeket jeleznek (p A tengeri uborka textúraváltozásában szerepet játszó oxidatív stressz Stichopus japonicus testfal alacsony hőmérsékletű kezelés során

Online közzététel:

2. ábra: Fehérjebontás és a CL aktivitásának változása SJBW-ben alacsony hőmérsékletű kezelés során 37 ° C-on. (a) SDS – PAGE fényképek a fehérje lebontásáról. Mindegyik mintából 10 mikrogrammot 10% (w/v) SDS – PAGE gélbe töltöttünk. HM, magas MARK; LM, alacsony MARK; (b) CL aktivitás fluorospektrofotométerrel mérve. Az adatokat három ismétlés alapján átlag ± SD értékként adjuk meg. A különböző betűk szignifikáns különbségeket jeleznek (p 2. ábra. A fehérje lebomlása és a CL aktivitásának változása az SJBW-ben alacsony hőmérsékleten végzett kezelés során 37 ° C-on. (A) SDS – PAGE fényképek a fehérje lebomlásáról. Tíz mikrogramm mintát töltöttünk 10% -ba (w/v) SDS – PAGE gél. HM, magas MARK; LM, alacsony MARK; (b) CL-aktivitás fluorospektrofotométerrel mérve. Az adatokat átlagként ± SD-ként adjuk meg három ismétlés alapján. A különböző betűk szignifikáns különbségeket jeleznek (p [ 19] A 2. b) ábra a CL aktivitását mutatja, amely fokozatosan növekedett és elérte a maximális értéket 156,1 ± 15,0 U/mg fehérje (p A tengeri uborka textúraváltozásaiban szerepet játszó oxidatív stressz Stichopus japonicus testfal alacsony hőmérsékletű kezelés során

Online közzététel:

4. ábra: MAPK foszforiláció SJBW-ben alacsony hőmérsékletű kezelés során 37 ° C-on. Sávonként húsz mikrogramm fehérjét töltöttek be. A kontroll volt a friss minta. A mintákat western blot-analízissel elemeztük, hogy meghatározzuk a p38, JNK és ERK foszforilációját. β-aktint használtunk terhelés kontrollként. Az eredmények három független kísérletre vonatkoznak.

Szabadgyökök képződése SJBW-ben alacsony hőmérsékletű kezelés során

A szabad gyökök képződését úgy értékeltük, hogy az SJBW liofilizált porját alacsony hőmérsékletű kezelésnek vetettük alá ESR spektroszkópia segítségével. Az 5. a) ábra a minták tipikus ESR spektrumát mutatja. A megfigyelt ESR jel hasonlított a legtöbb biológiai rendszerben termelt szabad gyökhöz, amelynek g = 2,03, amely megegyezett az ROS-eredetű gyökökkel. A relatív radikális jelintenzitást az 5. ábra (b) mutatja. A 37 ° C-on inkubált minták esetében a relatív radikális intenzitás jelentősen megnőtt (p 5) (p A tengeri uborka textúraváltozásaiban szerepet játszó oxidatív stressz Stichopus japonicus testfal alacsony hőmérsékletű kezelés során

Online közzététel:

5. ábra: ROS termelés SJBW-ben alacsony hőmérsékletű kezelés során 37 ° C-on. a) liofilizált SJBW ESR-spektrumai 37 ° C-on, különböző ideig indukált szabadgyöktermelést; (b) liofilizált SJBW szabadgyökszintje 37 ° C-on. A különböző betűk jelentős különbségeket jeleznek (p 5. ábra. ROS-termelés SJBW-ben alacsony hőmérsékletű, 37 ° C-os kezelés alatt. A) A liofilizált SJBW ESR-spektrumai 37 ° C-on, különböző időben indukált szabadgyökök termeléséhez; liofilizált SJBW 37 ° C-on. Különböző betűk jelzik a jelentős különbségeket (p A tengeri uborka textúraváltozásaiban szerepet játszó oxidatív stressz Stichopus japonicus testfal alacsony hőmérsékletű kezelés során

Online közzététel:

6. ábra: SJBW-ben javasolt jelkaszkádok vázlatos diagramja alacsony hőmérsékletű kezelés esetén 37 ° C-on.

Vita

Az SJBW egy epidermiszből, egy dermisből és egy belső kör alakú izomrétegből állt. [21] Az SJBW minőségének csökkenése jobban látható volt az epidermiszben, mint a dermisben, alacsony hőmérsékletű, 37 ° C-os kezelés során. Az oldható kollagéntartalom időbeli jelentős növekedését figyelték meg alacsony hőmérsékletű, 37 ° C-on végzett kezelés során SJBW-ben (1. ábra (b)). Hasonlóképpen, az oldható kollagéntartalom növekedését a hőkezelt abalone izomban és a bárány longissimus-ban találták öregedési periódusokban. [12, 15] Ezek a vizsgálatok azt mutatták, hogy a kollagén denaturálódott és lebomlott a különböző hőmérsékleti kezelések során. Jelen tanulmányban a texturális elemzési eredmények a kollagén feloldódásával magyarázhatók, mivel az oldható kollagén tartalmának változása egybeesik a keménység és a rágékonyság csökkenésével. Ehhez hasonlóan Lu és mtsai. [22] arról számolt be, hogy a nagyfejű pontyfilék keménysége és rugóssága 4 ° C-on 8 óráig nőtt, majd lassú csökkenés következett be a tárolás végéig.

A HMW és az aktin volt a fő fehérjekomponens az SJBW-ben, és lebomlásuk jelentős hatással lenne az izomszerkezetre. [23] Az aktin és a HMW lebomlását alacsony hőmérsékletű, 37 ° C-on végzett kezelésnél figyelték meg SJBW-ben (2. ábra (a)), hasonlóan a hering, a harcsa és a tilápia esetében megfigyelthez. [23, 24] Negatív összefüggés volt fenn a fehérje lebomlása és a CL aktivitás között 3 óra elteltével SJBW-ben; a fehérje lebomlása a CL 10 perc és 3 óra közötti akkumulációjának tulajdonítható (2. ábra (b)). Ladratet és mtsai. [25] arról is beszámolt, hogy a tengeri sügér tárolása során a fehérje lebomlása a CL hatásának tulajdonítható.

Megfigyelték az alacsony hőmérsékletű kezelés során az SJBW DNS károsodását (3. ábra (a)). A hőstressz DNS-törést indukálhat és gátolhatja a DNS-replikációt. [26] A Caspase-3 szerepet játszhat az állatok vázizmaiban megfigyelt megnövekedett DNS-károsodásban. [27] Az SJBW-ben a kaszpáz-3 aktivitása először növekedett, majd az idő múlásával csökkent az alacsony hőmérsékletű kezelés során (3. ábra (b)). A Caspase-3 aktiváció a nyíróerő csökkenésével járt együtt, és a mitokondriális útvonal szerepet játszott a szarvasmarha vázizmaiban a postmortem során. [28, 29] A katepszinek és a kaszpázok közötti korrelációval kapcsolatos korábbi vizsgálatok nem voltak meggyőzőek, ezért felvetődött, hogy a katepszinek a kaszpázok aktivációjától lefelé vagy felfelé fordulhatnak, és helyettesíthetik a kaszpázokat, vagy teljesen függetlenek, mivel hóhér proteázok. [30] Mindazonáltal ez a tanulmány azt mutatta, hogy a kaszpáz-3 a CL lefelé áramlik SJBW-ben.

Beszámoltak arról, hogy a MAPK szabályozza a DNS károsodását, valamint a kaszpáz-3 aktivitást a nucleus pulposus sejtekben és az emberi emlőrák sejtekben, az MCF-7-ben. [31, 32] A p38 és a JNK jelentős aktivációja az SJBW-ben (4. ábra) összhangban volt a Sarcophaga crassipalpis. [33] Az alacsony hőmérsékletű kezelés során azonban az ERK nem volt jelentősen foszforilálva az SJBW-ben. Az ERK foszforilációja szerepet játszik a sejtproliferációban és a sejtciklus progressziójában, míg a p38 és a JNK gyakrabban aktiválódnak a stressz és a sejtkárosodás hatására. [34] Ezért az ERK foszforilációja szerepet játszhat az apoptózis elleni védőjel szerepében SJBW-ben. Mindazonáltal ezek az eredmények azt mutatták, hogy a p38 és a JNK hozzájárul az SJBW minőségének változásához.

Korábban beszámoltak arról, hogy a ROS túltermelés hozzájárul a sejtek sérüléséhez. [35] Bár az SJBW textúrájának lebontásában szerepet játszó részletes mechanizmusok továbbra sem tisztázottak, az eddigi bizonyítékok arra utalnak, hogy az ROS részt vesz a sejtkárosodásban. Például az UVB-indukálta ROS elősegíti az apoptózist, a MAPK-aktivációval együtt a tengeri sün embriókban, és a hőstressz okozta ROS-termelést az Eisenia hortensis celomocitáiban. [36, 37] Hasonlóképpen, eredményeink azt mutatják, hogy az alacsony hőmérsékleten végzett kezelés szabad gyökök képződéséhez vezetett, amint azt az ESR-spektrumokban megfigyeltük (5. ábra). Számos tanulmány számolt be arról, hogy a ROS túltermelése káros a normális anyagcserére, és lipidperoxidációt, fehérjebontást és DNS károsodást vált ki. [38] A hőstressz 37 ° C-on serkenti a vázizmok ROS termelését és fehérje lebomlását. [39] A ROS által kiváltott DNS károsodást hőstressz során figyelték meg. [40] Megállapítottuk, hogy az alacsony hőmérsékletű fűtés nagy mennyiségű ROS-t generál 1 óra alatt, amikor fontos jelző fehérjék, például p38 aktiválódtak. A ROS által indukált-endoenzim által szabályozott textúra részletjelének kaszkádja még tisztázandó.

Következtetés

Az SJBW alacsony hőmérsékleten történő kezelése 37 ° C-on ROS-képződést, MAPK-foszforilációt, a CL-aktivációval szabályozott fehérjebontást, valamint DNS-károsodást és kaszpáz-3-aktivációt indukált. A ROS gyártása a legkorábbi esemény. Bár tovább kell vizsgálni, hogy az ROS és a downstream jelátvitel hogyan befolyásolja az SJBW textúráját alacsony hőmérsékletű kezelés során. Ezek az eredmények potenciálisan a tengeri uborka jobb feldolgozásához vezethetnek, hogy jobb, egyenletesebb minőségű termékeket nyerjenek.