Subarcolemmal mitokondriumok hiánya az elhízásban és a 2-es típusú cukorbetegségben

Absztrakt

Mitokondriális frakciók készítése.

Elektron transzportlánc aktivitás.

Az elektron transzportláncot az 1. ábra mutatja. A szukcinát-oxidáz (szukcinát: O2-oxidoreduktáz) aktivitását a szukcinát-dehidrogenázból kiinduló reakcióban mértük, és a szukcinát-oxidáció végtermékének, a fumarátnak a felhalmozódásának vizsgálatán alapult. Ez az eljárás egy korábban kifejlesztett vizsgálat módosítása (24). Röviden: a vizsgálat fumaráz- és almasav-dehidrogenáz-reakciókat hoz létre a fumarát oxidációja és a NAD redukálása érdekében, nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával és fluoreszcencia detektálással a NADH mérésére (18). A szukcinát-dehidrogenázt előaktiváltuk, amint azt korábban leírtuk, hogy megszüntessük a gátlást szorosan kötött oxalacetáttal (23). A CK aktivitását az izomrosttartalom indexeként mértük a biopsziás mintákban, amint azt korábban leírtuk (12, 18), és az elektron transzportlánc aktivitását CK aktivitásra normalizáltan fejeztük ki. A CK aktivitást 30 ° C-on mértük, figyelemmel kísérve a NADPH keletkezését kapcsolt enzimatikus reakcióban (hexokináz/glükóz-6P dehidrogenáz) (25).

mtDNS meghatározások.

Az mtDNS-tartalmat valós idejű PCR-rel mértük, a korábban leírtak szerint (26). Az 69 mp-os mtDNS-fragmens (14918–14986 nukleotidok) és a 77 bp-os β-globin fragmensének kimutatása, mindkettő Miller et al. (27) segítségével meghatároztuk az mtDNS relatív kópiaszámát diploid maggenomonként. A primereket és a FAM-jelzésű Taqman TAMRA szondákat (450025 sz.; Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia) a Primer Express szoftver 1.5-ös verziójával (Applied Biosystems) terveztük, és az 1. táblázat tartalmazza. DNS-t (mitokondriális és nukleáris) kivontunk szövetmintákból QIAamp DNS minikészlet segítségével (Qiagen, Chatworth, CA). Az egyes minták koncentrációját GeneQuant spektrofotométerrel (Pharmacia Biotech) határoztuk meg.

PCR körülmények.

Az mtDNS és a β-globin detektálását két külön reakcióként, de minden mintán ugyanazon a futtatáson keresztül végeztük. Az összes mintát két-két példányban futtattuk minden gén esetében. A reakciókat 1x Taqman Universal PCR Master Mix (4304437; Applied Biosystems), 1 μmol/l előre és hátra primer, 0,25 μmol/l FAM-jelzett Taqman/TAMRA szonda és 20 ng minta DNS jelenlétében végeztük. a végső térfogat 25 μl. Az amplifikációs reakciókat egy Prism 7700 spektrofluorometrikus hőciklerben (Applied Biosystems) hajtottuk végre a következő ciklus körülmények között: 50 ° C 2 percig uracil-DNS N-glikoziláz inkubálás, 95 ° C denaturáció és enzim aktiválási lépés 10 percig, majd 40 ciklus 95 ° C-os denaturáció 15 másodpercig, 60 ° C-os izzítás és megnyúlás 60 másodpercig. A fluoreszcencia spektrumokat az egyes PCR-ciklusok hőkezelési szakaszában rögzítettük. A FAM fluoreszcencia előállításához a Prism 7700-hoz tartozó Sequence Detection System szoftvert (1.7-es verzió) használtuk.

Küszöbciklus-számítások.

A küszöbérték ciklusszámát az SDS 1.7-es verziójával (Applied Biosystems) és az alapvonal automatikus beállításával számoltuk ki. A kiindulási érték a PCR-ciklusok átlagos fluoreszcenciája volt, 3-15-ig plusz a standard eltérés 10-szerese. Ezeket az értékeket használtuk a relatív kópiaszám-számítások kiszámításához a β-globin és az mtDNS PCR küszöbciklusszám-különbségeinek kifejezésével, amint azt korábban leírtuk (26): Rc = 2 ΔCt és ΔCt = Ctβ-globin –CtmtDNS, ahol Ct a küszöbérték ciklusszám és Rc a relatív példányszám.

Transzmissziós elektronmikroszkópia.

A mitokondriális eloszlások szubcelluláris szétválasztási módszereken alapuló értékelésének kiegészítéseként, amint azt fent leírtuk, egy TEM-et alkalmaztunk a szubarkolemmális mitokondrium rétegének vastagságának vizsgálatára, egy korábban publikált módszer alkalmazásával (28). A TEM-hez használt izommintákat apró darabokra (1 × 1 × 2 mm) vágtuk, 2,5% glutáraldehidbe rögzítettük, 1% osmium-tetroxidban utólag rögzítettük, dehidratáltuk, és Eponba ágyazottuk be hosszanti vagy keresztirányú irányban. A szekció síkjának optimalizálása céljából a toluidinkékkel festett szemitin (300 nm) metszetek kezdeti kis teljesítményű szűrése (29), az ultravékony (60 nm) hosszmetszeteket levágták, rézrácsokra szerelték és ólom-citráttal festették (30). és uranil-acetát (31). A metszeteket TEM (JEOL 100CXII) alkalmazásával vizsgáltuk 80 kV gyorsítófeszültségen. A subarcolemmal mitokondrium vastagságát (μm) hosszanti irányban képelemző rendszerrel mértük (National Institute of Health kép 1.61).

Statisztika.

Az adatok átlagként ± SE-ként kerülnek bemutatásra, hacsak másként nem jelezzük. ANOVA-t alkalmaztak a mitokondriumok csoportjainak és szubfrakcióinak összehasonlítására, az ANCOVA-t pedig az életkor és a nem hatásainak kiigazítására végezték el. Lineáris regressziót és lépésenként többszörös regressziót alkalmaztunk az izom-elektron transzportlánc aktivitás és az inzulinérzékenység összefüggéseinek vizsgálatára.

EREDMÉNYEK

Kutatási önkéntesek.

Az önkéntes kutatók klinikai jellemzőit a 2. táblázat mutatja. Az elhízott nem cukorbeteg és az elhízott 2-es típusú diabéteszes csoportokat életkoruk és BMI-jük szerint egyeztettük. Az inzulinérzékenység általában alacsonyabb volt a 2-es típusú cukorbetegségben szenvedőknél, de nem különbözött szignifikánsan az elhízott kontroll alanyoktól (P = 0,17). Az éhomi plazma glükóz és HbA1c magasabb volt a 2-es típusú cukorbetegeknél, mint az elhízott kontroll alanyoknál.

A mitokondrium szubcelluláris eloszlása.

A mitokondrium elektrontranszport-láncát ebben a sémában mutatjuk be, amely a négy légzési komplexet mutatja: NADH-dehidrogenáz (NADH-DH), szukcinát-dehidrogenáz (SDH), citokróm bc1 (bc1), citokróm-oxidáz (COX) és ATP szintáz (V komplex), amely a membránpotenciált az ADP foszforilezéséhez kapcsolja.

Az emberi vázizom hosszanti szakaszainak reprezentatív transzmissziós elektronmikroszkópiája látható egy sovány (T) és egy 2-es típusú cukorbeteg (DM) kutató önkéntestől (bar = 2,5 μm). A subarcolemmal mitokondriumok perinukleáris eloszlásának vastagságát képelemzéssel mértük (National Institute of Health 1.61 kép), és megfigyelhető, hogy jelentősen kimerült 2-es típusú cukorbetegségben.

Az amplifikációs primerek és a próbák szekvenciája

A kutató önkéntesek klinikai jellemzői

Elektron transzportlánc aktivitás az emberi vázizom subarcolemmalis és intermyofibrillaris mitokondrium frakcióiban

Mitokondriális DNS-tartalom a vázizomzatban sovány, elhízott és 2-es típusú cukorbeteg kutató önkéntesekben

Köszönetnyilvánítás

Ezt a vizsgálatot az Országos Egészségügyi Intézet, a Diabetes és Emésztőrendszeri és Vesebetegségek Intézete (DK49200) finanszírozta; a Pittsburghi Egyetem Általános Klinikai Kutatóközpontja (5 M01RR00056); valamint az Elhízás és Táplálkozás Kutatóközpont (P30DK462).

Hálásan köszönjük Carol Kelley, BSN, RN, a kutatás koordinátorának és a Pittsburghi Egyetem Általános Klinikai Kutatóközpont ápolószemélyzetének értékes hozzájárulását. Köszönetünket fejezzük ki a kutatás résztvevőinek is.