Miért különbözik a fehérjém molekulatömege az elméletileg várható súlytól?

Dr. Szczesna Karolina, vezető termékmenedzser és műszaki támogatás, Proteintech

miért

Western blot és molekulatömeg számítások

A Western blot (vagy immunblot) a fehérjék elemzésére általánosan alkalmazott molekuláris biológiai technika. A megjósolt fehérje molekulatömeg (MW) az összes fehérje aminosav molekulatömegének összege. Kiszámítható például az online ExPASy eszközzel. A számított MW azonban eltérhet a Western blot-nál megfigyelttől. Az alábbi ábra összefoglalja a leggyakoribb okait annak, hogy ez miért fordulhat elő (1. ábra).

1. ábra A megfigyelt és az elméleti MW közötti különbségek leggyakoribb okai. Hitel: Proteintech.
1. A szignálpeptid (és egy pro-peptid) lehasad

Sok szekréciós úton szállított fehérje 15-35 aminosav hosszúságú szignálpeptidekkel rendelkezik, amelyek főleg az N-végükön helyezkednek el. A szubcelluláris transzport során gyakran különféle proteázok hasítják őket, ami azt eredményezi, hogy az érett fehérje az előre jelzettnél alacsonyabb MW-on fut. A szignálpeptid jelenléte megjósolható különféle online eszközökkel, vagy megállapítható a korábban közzétett adatok alapján. Általában jól meg vannak jelölve a fehérje adatbázisokban, például az UniProt-ban. Ezenkívül a fehérjék egy részcsoportjának vannak pro-peptidjei - fehérje domének, amelyek a fehérje prekurzorokban vannak jelen. A fehérje-prekurzorokat proteázokkal kell feldolgozni annak érdekében, hogy pro-peptid nélkül funkcionális termék jöjjön létre (2. ábra).

2. Fordítás utáni módosítások (PTM)

A PTM-k a fehérjék kovalens módosításai, amelyek szintézisük után következnek be. Számos módosítást katalizálnak a szekréciós útvonalon elhelyezkedő enzimek, azaz az endoplazmatikus retikulum és a Golgi-készülék. A PTM-ek fontos szabályozói a fehérje-fehérje kölcsönhatásoknak, a fehérje stabilitásának, működésének, enzimatikus aktivitásának és lokalizációjának. A leggyakoribb módosítás a foszforilezés, amely túlnyomórészt a szerin-, tirozin- és treoninmaradékokon fordul elő. A foszforilezés, mint sok más PTM, gyakran átmeneti - a kinázok katalizálják a foszforilcsoportok kapcsolódását, míg a foszfatázok eltávolítják őket. A legtöbb fehérje N-terminális acetilezésen megy keresztül, ez egy enzimatikus reakció, amelyet N-terminális acetil-transzferázok (NAT) katalizálnak. Egyes aminosavmaradékok összekapcsolódhatnak oligoszacharidokkal az N- és O-kapcsolt glikozilezés néven ismert folyamatban. Az ubikvitináció, az ubiquitin hozzáadása a proteaszóma lebontásának általános kezdeti lépése. A PTM-ekről itt tudhat meg többet.

Glikozilezés és glikozálás

A legtöbb olyan fehérje, amely az endoplazmatikus retikulumhoz kapcsolódó riboszómákon szintetizálódik, glikozilezésen megy keresztül. Ez azt jelenti, hogy a polipeptidlánchoz cukorcsoportok kovalens kötését adják.

Foszforilezés


Az egyik leggyakoribb PTM a fehérje foszforilációja, amely szerin, treonin és tirozin maradványokon megy végbe. A foszforiláció szabályozza a fehérje működését, enzimatikus aktivitását, a fehérje – fehérje kölcsönhatásokat és a fehérje lokalizációját.

Egyetlen foszforilcsoport hozzáadása +/- 1 kDa-t ad az MW-hoz, ami gyakran meghaladja a standard SDS-PAGE felbontását. A többszörös foszforilációs helyek azonban szembetűnőbb MW-változásokhoz vezethetnek.

Ubiquitination


A fehérje ubikvitináció azt jelenti, hogy kovalens ubiquitint adnak a lizinhez, ciszteinhez, szerinhez, treoninhoz vagy közvetlenül a fehérje N-terminálisához. A proteomon keresztül történő ubiquitáció jelölheti a fehérjéket a lebomlás szempontjából.

3. Fehérjekomplexek

A fehérjekomplexek többsége nem kovalens kötésekkel társított fehérjékből áll. Ezek a kölcsönhatások a minta előkészítése és az elektroforézis során megsemmisülnek, és az egyes fehérjék monomerként futnak. Ennek oka az a tény, hogy az SDS-PAGE-t Western-blotoláshoz redukáló körülmények között hajtják végre. Ennek ellenére egyes fehérjekomplexek nem teljesen bomlanak meg, és a fehérjék továbbra is létezhetnek homo- vagy heteromer komplexek formájában, még redukálószerek, például SDS és β-merkaptoetanol jelenlétében is. A komplexek megfigyelt MW-ja később magasabb, mint a számított monomerek MW-ja. Gyakran megfigyelhető több sáv is, amelyek monomer és komplex fajokat képviselnek (3. ábra).

Megjegyzés: 20% β-merkaptoetanol (vagy 100 mM DTT) a 4X SDS mintapufferhez segíthet a nem specifikus sávok eltávolításában a fehérjekomplex disszociációja miatt.

3. ábra: Az NQO1 (11451-1-AP) egy olyan enzim, amely kinonreduktázként szolgál a detoxifikációs útvonalakban részt vevő hidrokinonok konjugációs reakcióival, valamint bioszintetikus folyamatokkal, például a glutamát maradékok K-vitamintól függő gamma-karboxilezésével. a protrombin szintézisében. Az NQO1 három izoformával rendelkezik: 26, 27 és 31 kDa MW, és enzimatikus aktivitásához homodimerek (66-70 kDa) képződése szükséges.

Az Mlx-kölcsönhatásban lévő fehérje (MLXIP, más néven MONDOA) (13614-1-AP) transzkripciós faktorként működik, heterodimert alkotva az MLX fehérjével. Ez a komplex megköti és aktiválja a CACGTG E dobozokból történő transzkripciót, szerepet játszik a glikolitikus cél transzkripciós aktiválásában és a glükózra reagáló génszabályozásban. Az MLXIP három izoformával rendelkezik: 110, 57 és 69 kDa, az MLXIP-MLX heterodimer MW-ja pedig 130 kDa. Hitel: Proteintech.

4. Fehérje izoformák

Az eukariótákban az újonnan átírt pre-mRNS-ek differenciális mRNS-érési lépéseken mennek keresztül, ami olyan mRNS-fajokhoz vezet, amelyek az exonok számában és hosszában különböznek - fehérjét kódoló szekvenciák. Ugyanannak a génnek a fehérje variánsait tekintjük fehérje izoformáknak. A fehérje izoformák szöveti expressziós mintázatokban különbözhetnek egymástól, és megkülönböztető fiziológiai szerepük lehet. Változatos exontartalmuk miatt a fehérje izoformák MW-ban eltérhetnek (4. ábra). Ezenkívül az mRNS-ek egynél több transzlációs kezdőhelyet (TSS) tartalmazhatnak, amelyek a fehérjék N-terminálisának kezdetét jelzik. Több TSS használata fehérje izoformákat hoz létre, amelyeknek külön N-végük van, és ezért eltérő a MW.

Az extrakciós puffer megválasztása elengedhetetlen az antitest keresztreaktivitásának csökkentéséhez. Ha az elemzett fehérje citoplazmatikus, akkor enyhe extrakciós puffer, amely nem vonja ki a nukleáris fehérjéket (például szaponint használva detergensként), alkalmasabb lehet a nem-specifikus keresztreaktivitás csökkentésére a nukleáris fehérjékkel. A fehérje poliakrilamid-gélről egy membránra való átvitelét követően a blokkoló puffer típusa, a membránok primer és szekunder antitestekkel való inkubációs ideje és a mosási lépés optimalizálást igényel. Javasoljuk a különféle termelt antitesttípusok összehasonlítását a célfehérjével. Ha poliklonális antitestekkel mutatunk keresztreaktivitást, akkor előfordulhat, hogy nem olyan monoklonális antitestekkel találkozunk, amelyek specifikus epitóp ellen termelődnek, nem pedig a teljes fehérjeszekvencia vagy egy nagyobb fehérjefragmens ellen.

b. Nem specifikus proteolitikus hasítás és fehérjebontás

A fehérjék nem specifikus proteolitikus hasításnak és lebomlásnak lehetnek kitéve. A sejtek és szövetek lebontása extra- és intracelluláris proteázokat szabadít fel, amelyek képesek hasítani a fehérjéket polipeptidekké. Ezért létfontosságú a lízispufferek kiegészítése proteázgátlókkal, amelyek blokkolják a proteázok aktivitását. Javaslat a sejtek lízisének elvégzése jégen a fehérjebontás további megakadályozása érdekében. Mind a proteolitikus hasítás, mind a lebontás különböző mértékben befolyásolhatja a fehérjéket, és alacsonyabb MW-os fehérjefragmenseket eredményezhet.

Megfigyelt MW

1. PTM-ek (lásd a 2. pontot).

2. Az antitest hosszabb szekvenciájú fehérje izoformát detektál (lásd a 4. pontot).

3. Fehérjekomplexek (lásd a 3. pontot).

1. A szignálpeptid hasítása (lásd 1. pont).

2. Az antitest rövidebb szekvenciájú fehérje izoformát detektál (lásd a 4. pontot).

3. Nem specifikus fehérje hasítás (lásd az 5b. Pontot).

1. Fehérje izoformák (lásd a 4. pontot).

2. Egy fehérjetermék, de eltérő poszttranszlációs módosításokkal (lásd a 2. pontot).

3. Az antitest fehérjét detektál pro-peptiddel és anélkül (lásd 1. pont).

4. Fehérjekomplexek (lásd a 3. pontot).

5. Antitestek keresztreaktivitása (lásd az 5a. Pontot), valószínűleg az immunogén szekvencia homológiájának köszönhető.

1. Fehérjehasadás (lásd az 5b. Pontot).

2. Fehérjebontás (lásd az 5b. Pontot).

- Ügyeljen arra, hogy tartalmazzon megfelelő kezelőszerveket (lásd az 5a. Pontot).

- Lehetséges, hogy további protokolloptimalizálásra van szükség (lásd az 5a. Pontot).