A kolin enyhíti az akut újszülött etanol-expozíció okozta egyensúlyhiányt

Absztrakt

BEVEZETÉS

A magzati alkohol-spektrum zavar (FASD) számos olyan fizikai és fejlődési rendellenességet fed le, amelyek az etanol terhesség alatti expozíciójának következményei. A FASD gyanúja szerint az összes élveszületés 1% -át érinti (1). A magzati alkohol szindróma (FAS), a FASD legsúlyosabb megnyilvánulása, a mentális retardáció legfőbb ismert oka a nyugati világban (2). A FAS előfordulása konzervatív becslés szerint 0,97/1000 születés (2), és akár 1000/1000 élveszületés esetén is 43 lehet az erősen ivó terhes nőknél (3). A kisagy rendellenességeit Jones és Smith észlelte először egy FAS-ban szenvedő gyermek boncolása alapján (4). Az FASD-ben szenvedő betegek csökkent agyi térfogatát azóta több vizsgálatban is megfigyelték (5–9). Ezekkel a kisagyi szerkezeti hibákkal együtt a kisagy működését is zavarja a prenatális etanol expozíció. A FASD-ben szenvedő gyermekeknél és felnőtteknél kisagyi rendellenességek vannak; beleértve a járás, a testtartás egyensúlyát, a mozgáskoordinációt és a szemhéj kondicionálását (10-12).

Az állatmunka megerősíti az emberekben talált eredményeket. A cerebelláris Purkinje sejtek különösen érzékenyek az etanol által kiváltott pusztulásra vagy károsodásra a posztnatális periódusban patkányokban (13-15), és mind a cerebelláris Purkinje sejtek, mind a cerebelláris granulátum neuronok száma jelentősen csökken (16). A kialakuló kisagy különösen érzékenynek tűnik az alkohol egyszeri adagjával szemben a posztnatális nap (P) 5 körül, párhuzamos veszteségekkel Purkinje és granulátum neuronokban (17; 18). A kisagyi függő viselkedési változások a posztnatális periódus alatt bekövetkező etanol-expozíciót követően is megfigyelhetők, ideértve a párhuzamos oszlopok hiányát, a szemhéjak kondicionálását és a tipli keresztezését (19–22.

A kolint, a lecitint (foszfatidilkolin) és a citikolint (citidin-difoszfát-kolin) az 1980-as évek eleje óta cerebroaktív gyógyszerként vizsgálták (23). A kolin hatását a fejlődő alkohol-expozíció hatásainak enyhítésére Thomas és munkatársai írták le először. (24) A kolin enyhíti az etanol néhány viselkedési hatását, ha azt egyidejűleg vagy az etanol expozíció után adják; például javíthatja a diszkriminációs tanulást, a hiperaktivitást és nyomon követheti a szemhéjak kondicionálását (19; 24-28). Ez a kezelés azonban nem befolyásolja az etanol két kisagytól függő viselkedésre gyakorolt hatásának enyhítését; késlelteti a szemhéj kondicionálását és a motoros koordinációt (19; 29).

A kolin megvédhet az etanol expozíció okozta strukturális és biokémiai hiányoktól is. A kisagyi granulátum neuronok in vitro modelljében az etanol csökkenti az L1 sejtadhéziós molekula (L1) -függő neurit kinövését és a downstream jelátvitelt (30-32). A kolinnal való kiegészítés az etanol-expozíció előtt javítja a neuritok kinövését és jelátvitelét etanol jelenlétében (30). A jelenlegi vizsgálatot annak eldöntésére végeztük, hogy a kolin-kiegészítés az etanol P5-re történő akut expozíciója előtt csökkentené-e az etanol hatásait a dübel keresztezési teszten, az egyensúly és koordináció tesztjén, amely nagymértékben támaszkodik az egerek normális kisagyi működésére (21).

MÓD

Állatok; prenatális kezelés

A C57Bl6/J egereket AAALAC akkreditált létesítményben tartottuk a Marylandi Egyetem Orvostudományi Karán. A helyiségeket hőmérséklet-szabályozással (22 ° C) 12 órás világos/sötét ciklussal (07:00 és 19:00 között világítják). Valamennyi eljárást a Baltimore-i Marylandi Egyetem Intézményi Állatgondozási és Felhasználási Bizottságának (IACUC) előzetes jóváhagyásával hajtották végre, és összhangban voltak a Nemzeti Egészségügyi Intézet által az állatgondozásra vonatkozó iránymutatásokkal.

Az egereket párban helyezték el, egy nőstényt és egy hímet. A nőstényeket naponta ellenőrizték, hogy vannak-e spermium-pozitív dugók. Az első reggel egy dugót láttak embriónapnak (E) 0,5 jelölni. E4,5-től a kölykök elválasztásáig a posztnatális napon (P) 21-én a gátaknak kolinhiányos pellet-étrendet adtak (518753, Dyets, Bethlehem PA). Az elválasztás után a gátakat egy hétre ismét normál étrendbe helyezték, az újabb párzási ciklus előtt. A kölyköket kolinhiányos pellet diétán tartották a teszt napjáig.

Szülés utáni állatok; az expozíció előtti kezelés

A születéstől számított két napon belül a kölyköket pszeudorandom módon osztották be a nyolc csoport egyikébe úgy, hogy egyetlen almához legfeljebb egy hím és egy nőstény került hozzárendelésre. A posztnatális kezelések 2 (expozíció előtti) × 2 (expozíció) × 2 (expozíció utáni) kialakításúak voltak: az etanol beadását megelőzően sóoldat (10 μl normál sóoldat (0,09% nátrium-klorid)) vagy kolin (10 μL 18,8 mg/ml kolin-klorid; C7527, Sigma, St Louis MO) naponta egyszer szubkután, P1 - 5 (születési nap = P0) 9 órakor.

Szülés utáni állatok; kitettség

Az expozíció etanol (6,0 g/kg) vagy Intralipid® (I-141, Sigma) volt, két részre osztva, két órás különbséggel, intragasztrikus szondán keresztül, P5-en, 1 órával a kolin vagy sóoldat injekció után. Az etanolos oldatot az Intralipid®-ben 13,6% (v/v) végkoncentrációra állítottuk elő, és az etanolmentes oldatot izokalóriává tettük 202 mg maltóz-dextrin hozzáadásával az Intralipid®-be. Az összes kölyköt eltávolítottuk a gátról, és 10 percre 37 ° C-os melegítőpárnára helyeztük, miközben az egész almát beáztattuk. Mindegyik kölyköt steril Clay Adams 7401 tubussal szoptattuk, amely egy Hamilton fecskendőhöz volt csatlakoztatva. A cső csúcsát kukoricaolajba (Sigma) mártották kenés céljából, majd a csövet óvatosan a nyelőcsőbe vezették a gyomorba, és az etetőoldatot lassan befecskendezték. A kölyköket az utolsó állat szoptatása után azonnal visszatették a gátba. Ezt az eljárást megismételtük az etanol második dózisával. Körülbelül 10 percbe telt minden alom záporozása. Az állatok 100% -a túlélte az etanol beadásának napját.

Postnatalis állatok: expozíció utáni kezelés

A kezeléseket fiziológiás sóoldattal vagy kolin-kloriddal végeztük, a fentiek szerint, naponta egyszer, a P6 - 20 értéktől.

A vér alkoholkoncentrációja

Négy állatot etanollal kezeltünk a fentiek szerint, és 2 vagy 4 órával eutanizáltuk a második szondázás után, és az etanol vérkoncentrációját az Ethanol L3K (Diagnostic Chemicals Limited, PE, Kanada) határozta meg.

Dübel keresztezési teszt

Nemenként és kezelési csoportonként hat állatot teszteltünk P30-on. A vizsgálatot megelőzően legalább 1 órán át vörös lámpával világító tesztterembe szoktak. A mérlegkészülék egy vízszintesen orientált dübelrúdból (0,635 cm átmérő × 120 cm hosszúság) állt, amelyet 3 cm-es időközönként jelöltek, és körülbelül 75 cm-re felfüggesztették a fogószekrény belsejében lévő műanyaggal borított párna felett (90 × 42 × 17 cm). . Az egyik végén sötétített menekülési góldobozt (21 × 10 × 17 cm) rögzítettek. Az első próba előtt az alanyokat 9 cm-re helyezték el a céldoboztól, és 1 percig hagyták őket belépni és a kapuba szoktatni, mielőtt 30 másodperces próbaidőszakra visszatérnének a háziketrecbe.

Az alanyoknak 5 kísérletet kaptak a tipli rúd keresztezéséhez. Minden kísérlet során az állatot a rúd kapufájával szemben a 111 cm-es kiindulási helyzetben helyezték el, és hagyták, hogy a rúdon a céldobozig haladjon. Minden kísérlet akkor ért véget, amikor az egér leesett vagy megcsúszott és a tipli fölé függesztve lógott. Azoknál az egereknél, amelyek elérték a góllövést, 10 másodpercet kaptak a góllövőben, mielőtt újra helyezték őket a rajtnál, és újra keresztbe engedték őket. 5 kísérlet után az egereket visszahelyezték az otthoni ketrecbe. Az 5 kísérlet mindegyikén megtett távolságot összesítve adták meg a teljes megtett távolságot (cm). A teljes megtett távolságot használták teljesítményfüggő mérőszámként.

Statisztika

Minden adatot az átlag ± az átlag standard hibájaként adunk meg. A testsúly adatait minden korosztálytól függetlenül elemeztük, kétirányú varianciaanalízissel (ANOVA), a nemek és a kezelési csoport tényezőivel. A tipli keresztezési adatokhoz egy kezdeti kétirányú ANOVA-t futtattunk (a nem és a kezelési csoport mint tényező), egyirányú ANOVA-k követésével a nemen belül. Ezután az adatokat további négy csoportra bontottuk, nemek és P5-en való expozíció alapján. Az ANOVA-k egyik módja az a priori hipotézis tesztelése volt, miszerint a kolinkezelések javítanák az eredményeket az etanollal kezelt állatokban, a kontroll állatokban azonban nem. Ahol az ANOVA szignifikáns hatást azonosított, post-hoc páronkénti tesztet végeztek a Fisher legkevésbé szignifikáns különbség tesztjével a II. Típusú hiba lehetőségének minimalizálása érdekében („hamis negatív” (33)). A nem parametrikus adatok esetében az ANOVA rangsorban történő egyirányú futtatását a Kruskal-Wallis teszt alkalmazásával, majd post hoc Mann Whitney U tesztekkel végeztük. Az összes teszt esetében a statisztikai szignifikanciát alfának ≤0,05 értékre állítottuk be. A statisztikai szoftver a SigmaPlot v.12.3 volt (Systat Software Inc., San Jose, CA).

A nyolc kezelési csoport releváns összehasonlításának tekintettük az expozíciós körülményeket megosztó csoportok közötti összehasonlításokat (azaz az Intralipid® vagy az etanol csoportokon belül), vagy ha megegyeztek az expozíció előtti és utáni körülmények között (pl. SIC vs. SEC). Más összehasonlításokat (pl. SIS és SEC) nem írunk le.

EREDMÉNYEK

A tipli keresztezési tesztben megtett teljes távolság nőstény és hím egerek esetében. A gátakat kolinhiányos étrendre helyeztük az embrionális 4.5. Napon a kölykök elválasztásáig. A kölyköket a vizsgálatig kolinhiányos étrenden tartották. A kölyköknek 5 próbát kaptak a tipli bejárásával. Az öt kísérlet mindegyikéhez a keresztezett tipli hosszát hozzáadtuk, hogy megadjuk a teljes megtett távolságot. A nőstények szignifikánsan nagyobb távolságokat tettek meg, mint a hímek az egyes kezelési csoportokban, ezért a grafikonok a kezelési csoport hatását mutatják az egyes nemeken belül. Kezelési csoport: XYZ-X vagy sóoldat (S), vagy kolin (C) a P1-P5-ből; Y vagy Intralipid® (I), vagy etanol (E) a P5-n; Z vagy sóoldat (S) vagy kolin (C) a P6-P20-ból. Az oszlopok az egyes kezelési csoportok átlagos teljes távolságát jelzik (n = 6) ± SEM. A statisztikai elemzést a 2. táblázat mutatja .

2. táblázat

Statisztikai elemzés a Dowel Crossing esetében, teljes távolság.

EffektDübel átkelésAllANOVA F1,80 = 4,749, p = 0,032 * nem; F7,80 = 13,774, p * félkövér jelzi a szignifikáns hatást

Nőstények

Először páros bontásban hasonlítottuk össze az etanol hatását mind a négy kezelési csoportra (S vagy C előzetes expozíció, S vagy C expozíció utáni; 2. táblázat). Az etanol szignifikánsan csökkentette a teljes távolságot az egyes kezelési csoportokon belül.

Ezután megvizsgáltuk a kolin hatását az Intralipid®-nek kitett nőstény állatokra. Nem volt szignifikáns különbség (F3,20 = 2,549, p = 0,085) az Intralipid®-nek kitett női csoportok között.

Lábjegyzetek

Érdekkonfliktus: Minden szerző a Maryland University, Baltimore munkatársa; Az SMM pénzügyi támogatást kapott a Gyermekek Környezetvédelmi Egészségügyi Hálózatának 2015. évi találkozóján való részvételhez; A CFB támogatási támogatást kapott Gerbertől. Nincsenek összeférhetetlenségek.