Határok az immunológiában

Gyulladás

Szerkesztette

Rudolf Lucas

Georgia Georgia College, Augusta University, Amerikai Egyesült Államok

Felülvizsgálta

Denise D. Belsham

Torontói Egyetem, Kanada

Hugo C. Castro-Faria-Neto

Oswaldo Cruz Alapítvány (Fiocruz), Brazília

A szerkesztő és a lektorok kapcsolatai a legfrissebbek a Loop kutatási profiljukban, és nem feltétlenül tükrözik a felülvizsgálat idején fennálló helyzetüket.

Cikk letöltése
- PDF letöltése
- ReadCube
- EPUB
- XML (NLM)
- Kiegészítő
  Anyag
Exportálás
- EndNote
- Referencia menedzser
- Egyszerű TEXT fájl
- BibTex

OSZD MEG

Eredeti kutatás CIKK

Orvostudományi Osztály, Orvostudományi Kar, Kaliforniai Egyetem, Riverside, Riverside, Kalifornia, Egyesült Államok

Bevezetés

Az USA lakosságának több mint a fele túlsúlyos, teljes harmada pedig elhízott (1). Az elhízottak száma az elmúlt 30 évben folyamatosan növekedett (2). Az elhízásnak ez a növekedése egybeesett a társbetegségek, például a 2-es típusú cukorbetegség, a szív- és érrendszeri betegségek, agyvérzés és a hipotalamusz rendellenességeinek növekedésével, beleértve a meddőséget okozó reproduktív rendellenességeket (3–6). Az elhízás káros hatásai a termékenységre magukban foglalják a menstruációs ciklusok rendellenességeit, a petesejtek fejlődésének rendellenességeit, az anovulációt és a nőben a vetélések fokozott kockázatát (3); rosszabb spermiumminőség, csökkent spermiummennyiség és alacsonyabb tesztoszteronszint a férfiaknál (7). Jelenleg a párok 18% -ának szüksége van asszisztált reproduktív technológiára a teherbe eséshez (8), amelynek egy része széleskörű elhízásból származhat (9, 10). Bár több hipotézist is felvetettek (11–15), nem ismertek azok a mechanizmusok, amelyek révén az elhízás negatívan befolyásolja a reproduktív funkciót.

Az elhízást krónikus gyulladás jellemzi, a metabolikus markerek változásán túl (31). A megnövekedett zsírbetegség a gyulladásos citokinek növekedését idézi elő a keringésben (32, 33), például: tumor nekrózis faktor (TNFα) és interleukinek, IL-1β, IL-6 (34), elsősorban a zsírszövetbe történő makrofág infiltráció következtében és későbbi aktiválásuk. Kimutatták, hogy a gyulladásos citokinek negatívan befolyásolják a reproduktív funkciót (35). Az akut gyulladás reprodukcióra gyakorolt hatása intenzív vizsgálati terület volt, és ezek a vizsgálatok megállapították, hogy az agykamrában az LPS vagy a citokin beadása csökkenti a gonadotropin szintjét, csökkenti a GnRH neuropeptid felszabadulását és elnyomja a GnRH és LH génexpressziót (36–38). A korábbi vizsgálatokban alkalmazott akut, magas gyulladásos citokinek szintjével szemben az elhízás alacsony fokú, krónikus gyulladást vált ki, és a GnRH neuronokon keresztüli reprodukcióra gyakorolt hatását vizsgáltuk.

Az elhízás okozta gyulladás reproduktív funkcióra gyakorolt hatásainak elemzéséhez étrend-indukált elhízott (DIO) egereket használtunk. Jelentős törzskülönbségeket figyeltek meg a magas zsírtartalmú étrendre (HFD) reagálva, és az A/J, FVB/NJ és a BALB/cJ törzsek rezisztensek a DIO-val szemben, míg a DBA/2J és C57BL/6J híznak (39–41). A C57BL/6J egér különösen hű modellje az emberi metabolikus szindrómának, mivel elhízás, hiperinsulinémia, hiperglikémia és magas vérnyomás alakul ki, ha engedélyezik ad libitum hozzáférés egy HFD-hez (42, 43). A HFD-re adott válaszban mély nemi különbségeket mutatunk be. Pontosabban, a C57BL/6J hím egerek neuroinflammációt mutatnak, aminek következtében csökken a szinaptikus tüskék száma a GnRH neuronokon és csökken a GnRH mRNS szintje. Másrészt a nőstény egerek ellenállnak a neuroendokrin és gyulladásos változásoknak, és ez a védelem független a petefészek hormonoktól. Adataink együtt nemi specifikus hatásokkal járnak az elhízás okozta ideggyulladásban, funkcionális következményekkel a GnRH neuronokra.

Anyagok és metódusok

Állatok

A C57BL/6J egereket a Jackson Laboratóriumtól kaptuk 3 hetes korban. Egy hét akklimatizáció után véletlenszerűen a magas zsírtartalmú diétával táplált csoportba (HFD, D12492, 60% kcal zsírból; Research Diet, New Brunswick, NJ) és kontrollcsoportba (Ctr, D12450J, 10% kcal; Research Diet) sorolták be őket., New Brunswick, NJ) meghatározott számú hétig. Az állatokat 12 órás világos, 12 órás sötét ciklus alatt tartottuk, és táplálékot és vizet kaptak ad libitum. Valamennyi kísérletet a Kaliforniai Egyetem Állattenyésztési és Felhasználási Bizottságának jóváhagyásával és az Országos Egészségügyi Intézet Állatgondozási és Felhasználási Irányelveinek megfelelően végeztük 16 hetes állatok felhasználásával (3 héttel az elválasztás előtt, 1 hetes normál chow-val, 12 héttel). magas zsírtartalmú vagy kontroll étrend), hacsak másként nem jelezzük. Az elválasztás és a kísérleti étrend között eltelt héten tapasztalt személyzet minden állatot naponta kezelt a megszokás biztosítása és a stressz minimalizálása érdekében (44).

Fluoreszcensen jelölt mikroglia esetében CX3CR1-GFP egereket kaptunk a Jackson laboroktól (005582 törzs), és véletlenszerűen helyeztük őket a megfelelő étrendre 4 hetes korukban, hogy elemezzük a mikroglia morfológiájának változását. A CX3CR1-GFP (005582 törzs) és a CCR2-RFP (017586 törzs) keresztezése után kapott fluoreszcens GFP és RFP transzgénikus egereket, valamint mindkét allél heterozigóta egereit használtuk a hipotalamuszba történő monocita-toborzás megkülönböztetésére a rezidens mikroglia-tól. A GnRH-GFP egereket Dr. Suzanne Moenter (45) biztosította. A hímeket és nőstényeket külön elemeztük a nemi különbségek meghatározása érdekében. Nemenként és genotípusonként legalább 10 állatot elemeztek, hacsak az anyagok és módszerek részben szereplő specifikus elemzéshez másként nem utalunk. Statisztikai különbségek (o ® 780 (1: 300, 47-0451, eBioscience, San Diego, Kalifornia) és anti-CD11b PerCP-Cyanin5,5 (1: 300, 45-0112, eBioscience, San Diego, Kalifornia) PBS-ben, 5% EDTA, 0,4% BSA. Sytox ™ Green döglött foltot (30 nM, S-34860, ThermoFisher, Chino, CA) alkalmaztunk az elhalt sejtek kizárására, és a BD LSR II Flow Cytometer alkalmazásával végzett áramláselemzést. Az eredményeket a FlowJo szoftverrel (Tree Star, Inc.) elemeztük, és a statisztikai különbségeket Student T-tesztjével és Tukey posthoc tesztjével határoztuk meg.

Asztal 1. Antitestek.

Szövettani elemzések és immunhisztokémia

A Ctr vagy HFD után az egereket érzéstelenítjük, 20 ml PBS-sel és 20 ml 4% paraformaldehiddel perfundáljuk; és az összegyűjtött szövetek. Az agyakat 4% paraformaldehidben rögzítettük, paraffinba ágyazva 20 μm-re vágtuk. A tárgylemezeket para-xinmentesítettük xilolban és rehidratáltuk. Az antigén leplezését 10 percig tartó Tris-EDTA-0,3% Triton X-ben végzett hevítéssel hajtottuk végre, és az endogén peroxidázt 10 percig 0,3% -os hidrogén-peroxidban inkubálva leállítottuk. A tárgylemezeket ezután 20% -os kecskeszérummal blokkoltuk, és GnRH (1: 1000 PA1-121, Thermo Sci.) Vagy Iba-1 mikroglia (1: 300 cat # 019-19741, Wako) elleni primer antiszérummal inkubáltuk egy éjszakán át 4 ° C-on. C. A PBS-mosások után a tárgylemezeket biotinilezett kecske anti-nyúl IgG-vel (1: 300, BA-1000, Vector Laboratories, Burlingame, CA) inkubáltuk 30 percig. A gyártó utasításai szerint a Vectastain ABC elit készletet (Vector Laboratories) alkalmaztuk, majd a kolorimetriás festéshez a DAB peroxidáz készletet használtuk. A tárgylemezeket etanolban és xilolban dehidratáltuk, és fedőlapon csúsztattuk Vectamount-tal (Vector Laboratories).

A CX3CR1-GFP egerekből származó GFP-jelölt mikroglia, valamint a CCR2-RFP x CX3CR1-GFP egerekből származó piros és zöld színnel jelölt aktivált makrofágok vizualizálása érdekében 12 hét Ctr vagy HFD egeret érzéstelenítettünk, 20 ml PBS-sel perfundáltuk, majd 20 ml 4% paraformaldehid; az agyakat 4% paraformaldehidben utólag rögzítettük, OCT-ben lefagyasztottuk, és Leica kriosztát segítségével 20 μm-es metszetekre vágtuk. Az endogén fluoreszcenciát Leica mikroszkóppal tettük láthatóvá.

Western Blot

Ctr és HFD táplált egerekből boncolt hipotalamiból teljes sejtlizátumokat nyertünk, és a fehérje meghatározása után ugyanannyi fehérjét futtattunk SDS-PAGE-on, nitrocellulóz membránra vittük át, és vizsgáltuk: Postsynaptic density protein 95 (PSD-95; 1: 1000, Cat # 3409, sejtjelzés), szinaptofizin (SYPH; 1: 1000, kat. # 4329, sejtjelzés), idegsejt marker, mikrotubulusokkal társított protein 2 (MAP2; 1: 5000, cat # ab5392, Abcam) vagy β-tubulin (1: 1000, cat # sc-9104, Santa Cruz Biotechnology). A sávokat ChemiDoc képalkotó rendszer (Bio-Rad, Hercules, CA) segítségével számszerűsítettük.

qPCR elemzések

A hipotalamikat boncoltuk, az összes RNS-t extraháltuk és reverz átírást végeztük a Superscript III (Invitrogen, CA) alkalmazásával. A qPCR-t iQ SYBR Green szupermix és IQ5 valós idejű PCR gép (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) alkalmazásával hajtottuk végre a 2. táblázatban felsorolt primerekkel a következő körülmények között: 95 ° C-on 15 percig, majd 40 ciklusig 95 ° C 20 másodpercig, 56 ° C 30 másodpercig és 72 ° C 30 másodpercig. A szóban forgó gén mennyiségét úgy számítottuk ki, hogy összehasonlítottuk az egyes mintákra kapott küszöbérték-ciklust az ugyanazon menetben előállított standard görbével. A replikátumokat átlagoltuk, és elosztottuk a béta-2-mikroglobulin (B2M) háztartási gén átlagértékével ugyanabban a mintában ΔΔ Ct módszerrel. A GAPDH, Ywaz, TBP és B2M háztartási géneket elemző előzetes tanulmányok megállapították, hogy a B2M nem változik az étrenddel, és ezt követően normalizálásra használták. Minden egyes futtatás után olvadásgörbe-analízist hajtottak végre annak megerősítésére, hogy minden reakcióban egyetlen amplikon keletkezett. A genotípusok közötti expresszió statisztikai különbségét Student-ek határozták meg T-teszt, valamint Tukey HSD-je többszörös összehasonlításhoz JMP szoftver segítségével (SAS Intézet; Cary, Észak-Karolina).

2. táblázat. Alapozók.

Eredmények

A magas zsírtartalmú étrendben lévő hím egerek alacsonyabb szintű reproduktív hormonokat mutatnak

A C57BL/6J hím és nőstény egereket 1 héttel az elválasztás után magas zsírtartalmú étrendre (HFD) vagy kontroll étrendre (Ctr) helyeztük, és súlyukat hetente kétszer mértük. Amint azt korábban bemutattuk (26), a hím egerek súlyt kaptak a HFD-n, míg a nőstény egerek ellenálltak az étrend által kiváltott elhízásnak (DIO), és hosszabb HFD-expozíciót igényeltek, hogy azonos súlykülönbséget mutassanak a kontroll étrendben lévő egereknél (1A. Ábra, hím; 1B ábra, nő). Az előzetes tanulmányok azt mutatták, hogy a HFD-nek ugyanolyan ideig kitett nőstények, mint a hímek, nem mutatják az elhízás kedvezőtlen hatásait, amelyet jól illusztrálunk, míg sokkal hosszabb expozíció növelné annak kockázatát, hogy eredményünket összekeverjük az öregedés negatív hatásaival; így úgy döntöttünk, hogy a nőstényeket a HFD-n tartjuk, amíg hasonló súlygyarapodást nem érnek el, mint a hímek. Annak megállapítására, hogy a petefészek-ösztrogének vagy más petefészek-hormonok szerepet játszanak-e ebben a nemi különbségben, 4 hetes korukban ovariektomizáltuk (OVX) a nőstényeket, és a HFD-re és a Ctr-re helyeztük őket. Az OVX nőstények fogékonnyá váltak a DIO-ra (1C. Ábra). Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a petefészek hormonok védik a DIO-t.

9. ábra. Perifériás makrofágok beszivárgása a hím egerek hipotalamuszában HFD-n, de nem nőstény. (A), Az áramlási citometriás diagram a CD45 magas makrofág populáció jelenlétét mutatja, amely megkülönböztethető a CD45 alacsony mikrogliától, kifejezetten a HFD hím egerek hipotalamijában, a nősténynél azonban nem. Ez a populáció sem a hím, sem a nőstény egerekben nincs jelen a kéregben. (B), Az A. mennyiségi meghatározása. A statisztikai szignifikanciát (*) a Ctr (szürke sávok) és a HFD (fekete sávok) között Student's T-teszt, majd Tukey posthoc tesztje.

A rezidens mikroglia és a toborzott monocita eredetű makrofágok lokalizálásához CX3CR1-GFP és CCR2-RFP kettős transzgén hím egereket állítottunk elő. A CX3CR1 egy fraktalkin receptor, amelyet az agy mikroglia kifejezetten expresszál. A CCR2 egy kemokin receptor, amely részt vesz a monocita kemotaxisában és az infiltrációban; így az RFP expresszió jelenléte CCR2-promóter kontroll alatt beszivárgó aktivált makrofágokra utal. Ezeket az egereket Ctr-re és HFD-re helyeztük. A Ctr-ben csak a zölden jelölt, a CX3CR1-re pozitív mikroglia van jelen a mediobasalis hipotalamusz íves magjában (10. ábra, koronális metszet a 3. kamrával a kép jobb oldalán), míg a HFD-ben RFP-jelölt infiltráló makrofágok az agy parenchymájában lokalizálódnak a GFP-jelölt rezidens mikroglia mellett. Ezek az eredmények együttesen azt mutatják, hogy a HFD-t követő hipotalamusz parenchymába történő perifériás makrofágok toborzása csak hím egereknél fordul elő.

10. ábra. A CCR2-pozitív makrofágok az íves mag parenchymájában lokalizálódnak. Kétszer fluoreszcens egereket, ahol az aktivált makrofágokat genetikailag vörös színnel jelölik CCR2-RFP-vel, a rezidens mikrogliákat pedig zölden jelölik CX3CR1-GFP-vel, helyeztük a kontrollra és a HFD-re. A kontroll étrendben lévő egerek íves magjai csak zöld fluoreszcenciát tartalmaznak, míg a HFD-n lévő íves sejtmagok a rezidens mikroglia zöld fluoreszcenciáját és a vörös fluoreszcencia jelzik a perifériás makrofágok beszűrődését.

A GnRH neuron tüskék sűrűségének csökkenése az elhízott hím egerek hipotalamuszában

A makrofágok beszivárgása és a megemelkedett gyulladásos citokinek a hipotalamuszban szinapszis eliminációhoz vezethetnek (64–66); és a GnRH idegsejtek későbbi diszregulációja, amely megmagyarázhatja a csökkent GnRH, LH és tesztoszteron szintet a HFD hím egerekben. Tekintettel arra, hogy a GnRH idegsejtek számában nem észleltünk változásokat, ezután meghatároztuk, hogy vannak-e szinaptikus változások a HFD hím egerek és konkrétan a GnRH idegsejtek hipotalamijában. A Western blot elemzések alacsonyabb szintű excitációs posztszinaptikus sűrűségű (PSD) 95 fehérjét mutattak ki a HFD hím egerek hipotalamijában, míg a pre-szinaptikus fehérje szinaptofizin (SYPH) általános szintjeiben nem tapasztaltak változást, amelyet általában mindkét excitátor és gátló pre-szinaptikus helyek (11A. ábra). Ezzel szemben a PSD-95 és a szinaptofizin szintje nem változott a HFD-n lévő nőstény egerek hipotalamijában, összehasonlítva a Ctr nőstényekkel (11B. Ábra). Eredményeink a szinaptikus fehérje szintjének változását mutatják a DIO-ra fogékony hím egerek hipotalamuszában, de nem neuro-gyulladásra rezisztens nőstény egerek.

11. ábra. Csökkent PSD-95 szinaptikus fehérje szint a hím egerek hipotalamijában a HFD-n. A hipotalamusz-lizátumokat alkalmazó Western-blot a poszt-szinaptikus sűrűségű fehérje (PSD-95) alacsonyabb szintjét jelzi, a férfiaknál azonban nem a pre-szinaptikus fehérje-szinaptofizin (SYPH) szintjét (A) de nőknél nem (B). * Statisztikai szignifikanciát jelez o Kulcsszavak: nemspecifikus, citokin, GnRH, ideggyulladás, elhízás, hipotalamusz

Idézet: Lainez NM, Jonak CR, Nair MG, Ethell IM, Wilson EH, Carson MJ és Coss D (2018) Az étrend okozta elhízás makrofág infiltrációt és a gerincsűrűség csökkenését váltja ki a hímivarú, de nem nőstény egerek hipotalamijában. Elülső. Immunol. 9: 1992. doi: 10.3389/fimmu.2018.01992

Beérkezett: 2018. június 4 .; Elfogadva: 2018. augusztus 13 .;
Publikálva: 2018. szeptember 11.

Rudolf Lucas, Augusta Egyetem, Egyesült Államok

Denise D. Belsham, Torontói Egyetem, Kanada
Hugo Caire Castro-Faria-Neto, Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz), Brazília