A halak és a standardizált FETAX-vizsgálatok elegendőek-e a kétéltűek számára? Esettanulmány Xenopus laevis Lárvák vizsgálata biológiailag aktív anyagokkal, amelyek jelen vannak az állattenyésztési hulladékokban

1 Ökotoxikológiai laboratórium, Környezetvédelmi Tanszék, Spanyol Nemzeti Agrár- és Élelmiszerkutatási és Technológiai Intézet (INIA), Carretera de la Coruña, Km 7.5, 28040 Madrid, Spanyolország

Absztrakt

A biológiailag aktív anyagok akkor juthatnak el a víztérbe, ha az állati hulladék újrafeldolgozását fontolóra veszik. A közelmúltban megkérdőjelezték a szabványosított FETAX vizsgálatot, és egyes kutatók úgy vélték, hogy a halakkal végzett kockázatértékelés nem lehet eléggé védő a kétéltűek elfedésére. Jelen tanulmányban a Xenopus laevis akut vizsgálatot fejlesztettek ki annak érdekében, hogy összehasonlítsák a lárvák érzékenységét a halakkal vagy FETAX vizsgálatokkal; A lárvák expozíciójára állat-egészségügyi hulladékokban található állatgyógyászati gyógyszereket (ivermektint, oxitetraciklint, tetraciklint, szulfametoxazolt és trimetoprimot) és esszenciális fémeket (cink, réz, mangán és szelén) használtak. Lethal (

) és a szubletális hatásokat becsülték. Mind a halak, mind a FETAX vizsgálatokban rendelkezésre álló adatok általában véve jobban védettek, mint a jelenlegi tanulmányban megállapított értékek, de nem minden esetben. Ezenkívül az ivermektin, a cink és a réz okozta nem letális hatások jelenléte arra utal, hogy számos fiziológiai mechanizmus befolyásolható. Ezért ezt a fajta hatást alaposan meg kell vizsgálni. A jelen tanulmányban elért eredmények kibővíthetik a kétéltűeken lévő állati hulladékokból származó mikrotartalmú anyagokkal kapcsolatos információkat.

1. Bemutatkozás

Az állatgyógyászati gyógyszereket széles körben használják a betegségek kezelésére és az állatok egészségének védelmére [1]. Az étrendi növekedést elősegítő takarmány-adalékokat (növekedésserkentőket) az állatok takarmányába is beépítik, hogy javítsák növekedési sebességüket [2]. Az egyik legfontosabb probléma, amely akkor fordulhat elő, ha az állati hulladékokat hasznosításra, újrafelhasználásra és újrafeldolgozásra gondolják, az a biológiailag aktív anyagok jelenléte ezekben a hulladékokban, mint például az állatgyógyászati gyógyszerek, biocidek és takarmány-adalékanyagok, amelyek kis koncentrációban potenciálisan toxikus hatást gyakorolhatnak a vízi szervezetekre. Jelen munkában öt állatgyógyászati gyógyszert és négy esszenciális fémet, amelyeket ásványi anyagként vagy élelmiszer-adalékként használnak az állatállományban, akut statikus teszteken tanulmányozták. Xenopus laevis mint állatmodell.

A vizsgálatok elvégzésére kiválasztott állatgyógyászati készítmények az ivermektin, az oxitetraciklin, a tetraciklin, a szulfametoxazol és a trimetoprim voltak. Az utolsó két gyógyszert a kereskedelmi forgalomban lévő Septrin kemoterápiával megegyező arányok fenntartásával használták (400 mg szulfametoxazol és 80 mg trimetoprim). Ezeket a gyógyszereket azért választották ki, mert a kategóriájukon belül az állattenyésztésben használják őket leggyakrabban [3–6]. A négy vizsgált esszenciális fém a cink (Zn), a réz (Cu), a mangán (Mn) és a szelén (Se). Az étrendben az esszenciális fémek nyomkoncentrációjára sok biológiai folyamat, különösen az enzimfunkciók miatt van szükség, és ezek pozitívan befolyásolják az állatállomány növekedését és szaporodását [2]. Mivel néhány takarmányban az esszenciális fémek alacsonyak az ajánlásokhoz képest, ezeknek a fémeknek a pótlása szükséges a legtöbb állatfaj esetében, és ásványi anyag-kiegészítőként (pl. Calfostonic, Bovis) rendszerint hozzáadják a napi adaghoz.

A kétéltűek akut toxicitásának vizsgálatához jelenleg a Frog Embryo Teratogenesis Assay-Xenopus (FETAX) [7] módszert alkalmazzák. A FETAX assay egy 4 napos expozíciós standardizált teszt Xenopus laevis embriók a 8. és a 46. szakasz között, Nieuwkoop és Faber táblázata szerint [8]. Más nem szabványosított vizsgálatokkal szemben a FETAX vizsgálatnak az az előnye, hogy nagyszámú paramétert értékel egy vizsgálat során [9]. Mivel azonban nem ismert, hogyan befolyásolhatja az embrió stádiumban lévő toxikus anyagok expozíciója az érzékenységet, Hoke és Ankley megkérdőjelezték a FETAX teszt eredményeit és azok környezeti kockázatértékelésére való felhasználását [10].

Így a jelen tanulmány egyik célja egy akut vizsgálat kifejlesztése a lárvák és az embriók közötti toxikus anyagokkal szembeni potenciális érzékenység összehasonlítására. X. laevis. Sőt, a kétéltűek toxikus anyagokkal szembeni relatív érzékenységéről keveset tudni más hagyományosabb vízi tesztfajokkal, például a halakkal szemben. Bár jelentős mennyiségű fejlesztésbiológiai kutatás történt a X. laevis, kevés toxikológiai adat található erről a fajról a halakhoz képest [10]. A jelenlegi akut lárvák vizsgálatával megvizsgáltuk annak lehetőségét, hogy a halakon végzett kockázatértékelés nem lehet eléggé védő más vízi fajok, például a kétéltűek számára. A kapott eredmények kibővíthetik az állattenyésztési hulladékokban a kétéltűeken előforduló lehetséges mikrotermelő anyagok ökotoxikológiai hatásaira vonatkozó információkat.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Vegyszerek

A szulfametoxazolt, a trimetoprimot, az ivermektint és a trietilénglikolt (99% -os tisztaságú) a Sigma-tól (Steinheim, Németország) szereztük be. A tetraciklint (99% -os tisztaságú tetraciklin-hidrát) Aldrich-től (Milwaukee, WI, USA) szereztük be. Az oxitetraciklint (oxitetraciklin-hidroklorid ≥99% tisztaságú), cink-szulfátot (cink-szulfát 7-hidrát ≥99% tisztaságú) és réz-kloridot (réz II-klorid 2-hidrát) a Panreac (Barcelona, Spanyolország) biztosította. A mangán-szulfátot (mangán-II-szulfát-monohidrát ≥99% tisztaságú) és a nátrium-szelenit (nátrium-szelenit-5-hidrát elemzés céljából) a Merck-től (Németország) vásárolták. Az ultratiszta vizet Milli-Q Synthesis víztisztító rendszerrel nyertük.

2.2. Teszt szervezetek

Xenopus laevis ebihalak, 47. szakasz szerint Xenopus A fejlődési táblázatot [8] felnőtt állatok házon belüli tenyésztéséből nyertük. A felnőtteket műanyag akváriumokban helyezték el 10 fős csoportban, 40 liter deklórozott csapvízzel. A szobahőmérsékletet 22: 1 ° C-ra állítottuk 12: 12 órás fény: sötét fényperiódus alatt. A békákat pisztráng takarmány aprított pelletekkel (REPRODUCTORES, Dibaq, Spanyolország) etettük hetente kétszer, minden vízcsere előtt 2-3 órával. Az állatok manipulációját az American Society for Testing Materials [7] protokolljának megfelelően hajtották végre. Felnőtt ívása X. laevis humán koriongonadotropin (hCG-LEPORI 2500, Angelini, Olaszország) két injekciójával indukáltuk a hátsó nyirokzsákba, 8 órás különbséggel. A férfi minden injekciónál 400 nemzetközi egység (NE) hCG-t kapott. A nő az első injekciónál 250, a következő injekciónál 800 NE-t kapott. Az ebeket friss FETAX táptalajra cserélték, rozsdamentes acél szűrővel 5 napos utántrágyázással, és naponta kereskedelemben kapható halporos száraz élelemmel táplálták (SERA MICRON, Németország) ad libitum.

2.3. Toxicitási tesztek

Valamennyi eljárást a Spanyol Nemzeti Agrár- és Élelmiszerkutatási és Technológiai Intézet állatkutatási etikai bizottsága által jóváhagyott protokollok szerint hajtották végre. Előzetes tartomány-megállapítási kísérleteket végeztek a vizsgált vegyi anyagok megfelelő koncentrációtartományainak meghatározásához (az adatokat nem mutatjuk be). Ezután rövid távú teszteket (4 d) hajtottak végre a vizsgált anyagok akut letális toxicitásának megállapítására és a lehetséges szubletális hatások azonosítására.

2.3.1. Állatorvosi gyógyszerek

A vizsgálatokat 52 üvegedényben végeztük, 22 ± 1 ° C hőmérsékleten tartott vízfürdőben 12: 12 órás fény: sötét fényperiódus alatt. Az üvegeket egy 4 × 13 blokkba helyeztük, és a kezelési és replikációs helyzeteket véletlenszerűen osztottuk meg. 5 lárvából álló csoportokat tettünk ki minden üvegedénybe, amely 100 ml tápoldatot tartalmazott. Az összes vizsgálatot négy ismétléssel végeztük. Az expozíciókat a Frog Embryo Teratogenesis Assay számára alkalmas rekonstituált vizes közegben végeztük-Xenopus, FETAX táptalaj [11]. Az ebihalakat statikus vizsgálattal négy nap alatt négy különböző gyógyszer sorozatos hígításának tették ki: S + T, TC és OTC kezdeti névleges koncentrációja 50 és 100 mg/l, valamint IVE kezdeti névleges koncentrációja 1,075, 2,15 volt., 4.3, 8.6 és 17.2

g/l. A tetraciklin és az ivermektin korlátozott vizes oldhatósága miatt trietilén-glikolt használtunk hordozóanyagként. Az összes kísérletben az oldószer koncentrációja nem haladta meg az 1,6% (v/v) koncentrációt az ASTM irányelvei szerint [7]. A lárvákat naponta ellenőriztük morfológiai rendellenességek, fejlődési késedelem, rendellenes úszási viselkedés és mortalitás szempontjából, és az összes elhalt ebihalat megszámoltuk és eltávolítottuk.

2.3.2. Alapvető fémek

Az expozíciós körülmények megegyeztek a fent leírtakkal. Üvegek (

) véletlenszerűen két 3 × 14 blokkba helyeztük. Ebben az esetben nem használtak SC-t. Az ebeket négy különböző vegyület öt geometriai hígításának tették ki: cink-szulfátot (ZnSO4 * 7 H2O), réz-kloridot (CuCl2 * 2 H2O), mangán-szulfátot (MnSO4 * H2O) és nátrium-szelenitet (NaSeO3 * 5 H2O). az 1. táblázatban bemutatott megfelelő névleges fémkoncentrációk elérésének célja.

2.4. Statisztikai elemzések

Minden vizuálisan megkülönböztethető rendellenességgel rendelkező minta esetében probit analízist (Statgraphics 5.1, StatPoint Technologies, INC., USA) alkalmaztunk a hatáskoncentrációk kiszámításához az esetek 50% -ában (ECs50), 95% konfidencia intervallummal. Ugyanezt az elemzést alkalmazták a halálos koncentrációk (LCs50) kiszámításához. A végpontok szignifikanciáját a kontrolladatokhoz képest egyirányú varianciaanalízissel (ANOVA) értékeltük, Fisher legkevésbé szignifikáns eltérési eljárásával (LSD).,

), a Statgraphics 5.1 szoftverben.

3. Eredmények

Ödéma az optika és a hasi területeken X. laevis ebihal, amelyet az összes névleges Zn-expozíció-koncentráció (2,73, 5,46, 10,91 és 21,83 mg/l) okoz, kivéve a legalacsonyabbat (1,36 mg/L). O: optika és A: hasi.

4. Megbeszélés

A szennyező anyagokra vagy a komplex keverékekre vonatkozó környezeti kockázatértékelési protokollok ökotoxikológiai vizsgálatokat tartalmaznak a halakkal az akut és krónikus expozíció lárvaszakaszokra vagy felnőttekre gyakorolt hatásainak tanulmányozására. Ugyanígy a kétéltűek esetében különösen fontos lenne ismerni a biológiailag aktív anyagok, például a biocidek és az állatgyógyászati gyógyszerek által okozott akut és krónikus hatásokat a fejlődés különböző szakaszaiban. Ezenkívül továbbra is problémát jelent a kétéltűekkel végzett szabványosított toxicitási vizsgálatok hiánya és az ezt követő korlátozások a jó minőségű toxikológiai adatokban, akár prospektív, akár diagnosztikai értékelés céljából, és gyakran megakadályozzák a kétéltűek ERA-kba történő felvételét. A jelenlegi vizsgálat új szempontja az ökotoxikológiai vizsgálat alkalmazása a X. laevis, egy nem általánosan használt életkori szakasz, hogy összehasonlítsák a biológiailag aktív anyagok által okozott akut expozíció hatásait a FETAX vagy halvizsgálatokból nyert adatokkal.

g/l és a 48 órás LC50 érték D. magna 25 ng/L [27]. Az ivermektin hatásmechanizmusa miatt, Daphnia megállapították, hogy a legérzékenyebb laboratóriumi indikátor organizmus [27].

A FETAX assay akut hatásairól rendelkezésre álló adatok általában védettebbek, mint a jelenlegi vizsgálatban megállapított értékek X. laevis 47 stádiumú lárvák, de a halvizsgálatokból származó korábbi adatok nem mindig voltak elég védőek. Például, X. laevis a NaSeO3-nak kitett lárvák nagyobb érzékenységet mutattak, mint a szivárványos pisztráng [19] (2. táblázat). Ezen túlmenően az IVE, Zn és Cu által okozott nem halálos hatások jelenléte arra enged következtetni, hogy ezek az anyagok képesek voltak szervezetreakciót kiváltani. Például a Cu által érintett lárvák fejletlenek és színtelenek voltak, míg az IVE rontotta mozgásukat és tájékozódásukat. Hasonló hatások problematikusak lehetnek természetes környezetben azáltal, hogy növelik a lárvák ragadozásra való hajlamát, amint azt Yuan [28] közölte a trifenil-ón expozíció által okozott fehéresekre, vagy csökkentik a takarmányozási sikert, ami a növekedés és a fejlődés csökkenését eredményezi. A kognitív és pszichomotoros funkció változásai, például az IVE által kiváltott hiperaktivitás, általában a toxikus neuropathiához kapcsolódnak [29], míg a vesefunkció zavarai, vagy általánosabban az anyagcsere megváltozása okozhatta az ödémát a Zn-nek kitett állatokban (ábra 1).

A vizsgálatok alapján a FETAX-vizsgálat hasznosnak tűnik az ökotoxikológiai veszélyek felmérésében, de a halvizsgálatok nem mindig jelentenek kellő védelmet a kétéltűek szempontjából. Ezenkívül számos tanulmány adatai azt mutatják, hogy a késői stádiumú kétéltű lárvák érzékenyebbek lehetnek valamilyen vegyi anyagra, mint a hagyományos vízi bioindikátorok [30], amint ez a fémeknél és a kétéltűek azon fajai esetében is előfordul, amelyek teljes életciklusukat víz (pl. Pipidae, Cryptobranchidae), a lárva expozíció pontosabb lenne, mint a FETAX assay [18]. Ki kell emelni a kétéltű fajok tanulmányozásának és megelőzésének szükségességét. A különböző vegyületek által okozott szubletális hatások jelenlétét meg kell vizsgálni, figyelembe véve azokat a más végpontokat is, amelyek szubletális mintázatban számos fiziológiai mechanizmust befolyásolhatnak, például immunotoxicitást vagy az állati lárvaszakaszok szélesebb körét.

Közzététel

A szerzők semmilyen pénzügyi kapcsolatban nincsenek a cikkben említett kereskedelmi identitásokkal.

Köszönetnyilvánítás

Ezt a munkát az RTA 2010-00004-C02-00 és a CTM 2010 19779-C02-01 spanyol projektek finanszírozták. F. Martinit a „Consejería de Educación de la Comunidad de Madrid” spanyol szervezet és az Európai Szociális Alap támogatta. A szerzők köszönetet mondanak Pilar García-Hortigüela technikai segítségéért.