Fokozott nyálkahártya-antitest termelés és védelem a légzőszervi fertőzések ellen orálisan beadott baktérium kivonatot követően

Christian Pasquali

1 OM Pharma SA Genf, Genf, Svájc

nyálkahártya

Olawale szalámi

2 Biológiai és Orvostudományi Kar, Lausanne-i Egyetem, Service de Pneumologie, CHUV, Lausanne, Svájc

Manisha Taneja

2 Biológiai és Orvostudományi Kar, Lausanne-i Egyetem, Service de Pneumologie, CHUV, Lausanne, Svájc

Gollwitzer Éva

2 Biológiai és Orvostudományi Kar, Lausanne-i Egyetem, Service de Pneumologie, CHUV, Lausanne, Svájc

Aurelien Trompette

2 Biológiai és Orvostudományi Kar, Lausanne-i Egyetem, Service de Pneumologie, CHUV, Lausanne, Svájc

Céline Pattaroni

2 Biológiai és Orvostudományi Kar, Lausanne-i Egyetem, Service de Pneumologie, CHUV, Lausanne, Svájc

Koshika Yadava

2 Biológiai és Orvostudományi Kar, Lausanne-i Egyetem, Service de Pneumologie, CHUV, Lausanne, Svájc

Jacques Bauer

1 OM Pharma SA Genf, Genf, Svájc

Benjamin J. Marsland

2 Biológiai és Orvostudományi Kar, Lausanne-i Egyetem, Service de Pneumologie, CHUV, Lausanne, Svájc

Absztrakt

Bevezetés

A visszatérő légúti fertőzések (RTI-k) a morbiditás és a halálozás vezető okai, a terápiás lehetőségek nagyrészt a hagyományos antibiotikus kezelésekre korlátozódnak (1). Az RTI-k iránti fogékonyság oka változatos, de összességében azt tükrözi, hogy az immunrendszer nem képes megakadályozni a produktív fertőzéseket (2). Így az immunrendszer hatékonyságát fokozó kezelési rendszerek érvényes és ésszerű megközelítés.

Az immunrendszer éretlen születéskor, a mikrobiális kolonizációt és a gazda-mikroba kölcsönhatásokat követően érik és fejleszti a fertőzések hatékony ellenőrzésének képességét (3). Axenikus (csíra mentes) egerek felhasználásával végzett vizsgálatok, amelyekben nincsenek mikrobák, kimutatták, hogy mikrobiális kolonizáció hiányában limfopénia, a nyálkahártya IgA drasztikusan csökkent szintje és a hámgát integritásának romlása áll fenn (4). A legújabb kutatások rávilágítanak a gazda – mikroba kölcsönhatások fontosságára mind az egészség, mind a betegségek szempontjából, és ezek az adatok alátámasztják a fogadó mikrobiota modulálásának koncepcióját, a prebiotikumok vagy probiotikumok felhasználásával a betegségek megelőzésében (5). Alternatív megközelítés a tisztított mikrobiális komponensek vagy baktériumkivonatok közvetlen beadása, amelyek érési jeleket juttatnak az immunrendszerhez (6–9). Valójában mind a klinikai, mind a kísérleti vizsgálatok kimutatták, hogy a bakteriális kivonatok beadása számos betegség esetén hatékony lehet, például krónikus obstruktív tüdőbetegség, bakteriális vagy vírusos eredetű visszatérő légúti és húgyúti fertőzések, sípoló alsó légúti megbetegedések (WLRI) és a későbbiekben. asztma (10, 11).

Kísérleti tanulmányok alátámasztják azt az elképzelést, miszerint a baktériumok összetevőinek való kitettség befolyásolhatja a különféle kórokozókra adott választ. Az aeroszolos Haemophilus influenzae lizátummal előkezelt egereket különféle patogén baktériumok és gombák, köztük a Streptococcus pneumoniae, a Klebsiella pneumoniae, a Pseudomonas aeruginosa, a Bacillus anthracis és az Aspergillus fumigatus (12), védték a légúti fertőzések ellen. Ugyanez a kezelés védte az egereket a porlasztott influenza vírus ellen is (13). A 90-es években és újabban klinikai vizsgálatok kimutatták, hogy az OM-85 baktériumkivonattal (Broncho-Vaxom, Broncho-Munal, Ommunal, Paxoral, Vaxoral) forgalmazott kezelés hatékony volt a különböző RTI-kkel szemben (14–17). A morbiditás csökkentésének hatékonyságát szintén kimutatták az OM-85 alkalmazásával a visszatérő RTI-k által érintett gyermekeknél (18), és jelentősen csökkentette a vírus okozta WLRI gyakoriságát és időtartamát akut RTI-ben szenvedő óvodáskorú gyermekeknél (19). A mikrobiális kolonizáció általános hatásához hasonlóan a baktériumkivonatok által kiváltott immunstimulációs utak is változatosak. A legfrissebb adatok azt mutatják, hogy a TLR4 és a TLR2 stimulálható volt az OM-85-sel (20), és beszámoltak arról, hogy befolyásolják a T szabályozó sejtek tágulását és az 1. típusú T segítő válaszok fokozását (21).

Anyagok és metódusok

Egerek és fertőzések

A vér baktériumterhelésének számszerűsítése

Huszonnégy órával a fertőzés után vért vettünk és sorozatosan hígítottunk, majd LB (Klebsiella) vagy Mueller Hinton + 5% juhvér (Streptococcus) agarlemezekre helyeztük és egy éjszakán át inkubáltuk 37 ° C-on. 24 órás inkubálás után megszámláltuk a baktériumtelepeket, és a CFU-kat extrapoláltuk.

Betegség pontozása

Összesen 1 pont egy egészséges egérért; 2 pont egy rosszullét jeleit mutató egér esetében, beleértve az enyhe piloerekciót, kissé megváltozott járást és fokozott ambulációt; 3 pont egy egér esetében, amely erős piloerekció, összehúzott has, megváltozott járás és inaktivitás periódusának jeleit mutatja; 4 pont egy egér esetében, amely az előző csoport fokozott jellemzőivel rendelkezik, de kevés aktivitást mutat és halandóvá válik; és 5 pont egy döglött egérért.

Antitestek és áramlási citometria

A következő antitestek különböző kombinációit használtuk az áramlási citometriához. A tüdőben lévő dendritikus sejtek (DC) részhalmazainak elemzéséhez CD11b PerCP-Cy5.5, CD11c APC-Cy7, B220 FITC, MHC II Alexa Fluor 700, CD40 PE, ICOS-L PE, CD80 PE vagy CD86 kombinációja PE-t használtunk. A B-sejtek részhalmazainak elemzését CD19 PE, CD23 PE-Cy7, CD21 Pacific Blue, IgD FITC és IgM APC alkalmazásával végeztük. Influenza-specifikus CD8 + T-sejteket festettünk NP-tetramerrel 366–374. Minden antitestet a Biolegend-től (San Diego) vásároltunk, hacsak nem jelezzük. A festett sejteket BD FACS CANTO-n vagy LSRII-n szereztük be és FlowJo szoftverrel (Tree Star, Inc.) elemeztük.

Kvantitatív valós idejű PCR

A teljes RNS-t Tri reagens (Sigma Aldrich) alkalmazásával tisztítottuk az egerek teljes tüdejéből és légcsövéből nyert sejtekből. A valós idejű PCR-t a gyártók utasításai szerint, a quantifast SYBR green RT-PCR kit (Qiagen) felhasználásával végeztük. A következő primereket alkalmaztuk: béta-aktin 5'-CCCTGAAGTACCCCATTGAAC-3 'és fordított 5'-CTTTTCACGGTTGGCCTTAG-3'; influenza mátrix fehérje előre 5′-GGA CTG CAG CGT AGA CGC TT-3 ′, fordított 5′-CAT CCT GTT GTA TAT GAG GCC CAT-3 ′. Az adatok az influenza mátrixfehérje gén és a házfenntartó gén, a béta-Actin Cq értékének arányában vannak ábrázolva.

A hörgő-alveoláris öblítésből és a tüdőből származó sejtek elemzése

A BAL-t úgy végeztük, hogy a légutakat kétszer öblítettük 500 μl PBS/0,1% BSA-val. Az összes sejtszámot Beckmann Coulter Counter segítségével határoztuk meg. A BAL sejtjeit üveglemezekre fontuk Cytospin 3 (Shandon) alkalmazásával. A tárgylemezeket ezután Diff Quick festési készlet segítségével (Dade Behring, Siemens Healthcare Diagnostics, Deerfield, IL, USA) festettük, és a differenciális sejtszámot mikroszkóppal határoztuk meg. A makrofágok, a neutrofilek, az eozinofilek és a limfociták százalékos arányát 200 sejt teljes populációjában határoztuk meg.

A sejtek izolálásához a tüdőből a tüdőt PBS-sel perfundáltuk, majd 2 mg/ml kollagenáz IV-vel (Invitrogen-Gibco) kiegészített táptalajban emésztettük. Az egysejtű szuszpenziót úgy kaptuk, hogy az emésztett tüdőket 70 μM-es sejtszűrőn (Milian Falcon) szétvertük.

A splenociták in vitro aktiválása

A lépeket BALB/c egerekből izoláltuk és egyesítettük. A szövetet kollagenázt tartalmazó IMDM táptalajba helyeztük, kb. 2 mm-es kockákra vágtuk, és 45 percig inkubáltuk 37 ° C-on, enyhe rázással. Az inkubációt követően a megmaradt szövetet és táptalajt 70 μm-es sejtszűrőkön átnyomtuk és 0,2% BSA-t tartalmazó PBS-sel mostuk. A vörösvértesteket lizáltuk, és a sejteket Coulter számlálóval (IG Instruments, Zürich, Svájc) számláltuk. A tenyészeteket lyukanként 1 × 106 sejtvel 48 lyukú lemezeken (Nunc) 500 μl táptalaj térfogatával állítottuk be három példányban. A sejteket OM-85-sel stimuláltuk 1 mg/ml, 100 μg/ml, 10 μg/ml, 1 μg/ml vagy 0 μg/ml koncentrációban.

Statisztikai analízis

A Student csoport t tesztjét (párosítatlan, kétfarkú) vagy egyirányú ANOVA-t alkalmaztuk a szignifikancia szintek kiszámításához a kezelési csoportok között, a jelzések szerint. A grafikongenerálást és a statisztikai elemzést a Prism 5-ös verziójú szoftver (GraphPad, La Jolla, CA, USA) segítségével végeztük. A szórást (SD) használtuk.

Eredmények

Az OM-85 baktérium kivonat fokozott veleszületett választ vált ki, amely ellenőrzi az influenza vírus fertőzését