Útmutató a vegyület-specifikus stabil izotóp-elemzés használatához a molekulák sorsainak tanulmányozásához a szervezetekben és az ökoszisztémákban

Az idealizált izotópértékeket két aminosav (AA) esetében mutatjuk be három különböző organizmus szövetében, beleértve az elsődleges termelőt, az elsődleges fogyasztót (1 °) és a másodlagos fogyasztót (2 °) - vegye figyelembe, hogy ezek hipotetikus adatok a trendek szemléltetésére. . (A) a szén-izotóp értékeket mutatja. Az esszenciális AA fenilalanin esetében a Δ 13 CC-D (δ 13 CCfogyasztó - δ 13 CDiet) értéke mindkét fogyasztó esetében 0 ‰ volt. Ennek eredményeként a δ 13 CPhe értékek minden organizmus esetében azonosak voltak. Az alanin, amely nem esszenciális AA, az elsődleges fogyasztó jelentős mennyiségű szintetizálta ezt az AA-t de novo, ami magasabb δ 13 CAla-értéket eredményezett, mint az étrendje (azaz a termelő). Ezzel szemben a másodlagos fogyasztó az alanint étrendjéből (azaz az elsődleges fogyasztóból) közvetlenül a szövetébe vezette, ami mindkét fogyasztónak azonos δ 13 CAla értéket eredményezett. (B) a nitrogén izotóp értékeket mutatja. A AA forrású fenilalanin Δ 15 NC-D értéke mindkét fogyasztó esetében 0 ‰ volt. Ennek eredményeként a δ 15 NPhe értékek minden organizmus esetében azonosak voltak. Ezzel szemben a glutaminsav, a trofikus AA Δ 15 NC-D értéke hasonlóan pozitív mindkét fogyasztó számára. Ennek eredményeként a δ 15 NGlu értékek folyamatosan növekednek a termelőtől az egyes fogyasztókig.

A Silfer és munkatársai által készített minta tipikus aminosav (AA) kromatogramja. [53] derivatizációs módszer. Itt az X tengely az egyértelműség kedvéért megtört; tipikus injekciók

1 óra. Ide tartoznak a referencia gáz csúcsa (négyzet) és a mintából származó egyedi AA (kerekítve). Az egyszerűbb molekuláris szerkezetű AA általában korábban eluálódik (pl. Gly és Ser), míg a bonyolultabb AA-nak több időre van szüksége a GC oszlopon való áthaladáshoz (pl. Phe, Lys). Bár az egyértelműség érdekében egyetlen vonalat mutatunk be, a kromatogramok több vonallal rendelkeznek, amelyek különböző atomtömegeket képviselnek, majd ezeket integrálják az izotóp arányok kiszámításához. A szénanalízis során a vonalak a 44, 45, 46 atomi tömegeket képviselik; nitrogénelemzés során a 28., 29., 30. tömegek; a hidrogénelemzés során pedig az 1. és 2. tömeg.

A nitrogén izotóp diszkriminációs faktorok (Δ 15 NC-D, vagy δ 15 NC fogyasztói szövet - δ 15 NDiet elem) mediánértékei (folytonos vonal; a dobozok és a hibasávok a 25. és a 10. percentiliseket jelölik) 58 fajonként az egyes aminosavak (AA) esetében. ellenőrzött kísérletek és jól korlátozott terepi vizsgálatok során. A trofikus AA-k általában nagyobb Δ15 NC-D értékkel rendelkeznek, mint az AA forrás. Megjegyezzük, hogy a T/S jelzi az AA-t, amely akár trófiának, akár forrásnak minősíthető, és hogy a treonin külön y tengellyel rendelkezik. A 20 standard AA közül ötöt kizárnak itt, mert ritkán jelentik őket (arginin, cisztein, hisztidin, triptofán, tirozin). Ezenkívül a minta előkészítése során a glutamin átalakul glutaminsavvá és az aszparagin aszparaginsavvá. A vizsgálatokat (1) a [31] 1. kiegészítésében helyezték el; és (2) a [31] -ben leírt irodalomkutatás megismétlésével újabb tanulmányok hozzáadása céljából. A vizsgálatokat az S2 táblázat tartalmazza .

Absztrakt

1. Az ömlesztett szövetek stabil izotóp elemzése

2. A vegyület-specifikus izotóp-elemzés (CSIA) alapelvei

0 AA AAESS esetén (−0,1 ‰ és 0,3 ‰), de az AANESS Δ 13 CC-D értékei nagyobbak és változóbbak voltak (−0,5 ‰ és 2,4 ‰ között), tükrözve a közvetlen útválasztás és a nem novelláris szintézis kombinációját. fehérje étrendi makromolekulák [34].

0 ‰. Ezzel szemben a trofikus AA gyakran dezaminálási és transzaminációs reakciókon megy keresztül, amelyek 15 N-dúsulást eredményeznek, tükrözve a preferenciális dezaminálást és a könnyű nitrogén (14 N) végső kiválasztását. Ez a trofikus AA Δ 15 NC-D értékét eredményezi

2–8 ‰ [31]. Számos AA nem tartozik következetesen egyik kategóriába sem. A glicin és a szerin könnyen cserélnek nitrogént egymással, de kevés transzaminációban vesznek részt más AA-val. Ennek eredményeként ennek a két AA-nak a Δ 15 NC-D értékei gyakran hasonlóak egy organizmuson belül, de az étrendtől és a fiziológiai állapottól függően nagymértékben változnak a szervezetek között. A treonin látszólag gyakran részt vesz olyan transzaminációkban, amelyek δ 15 N-értékének csökkenése, nem pedig növekedése az egyes trofikus szinteknél, ami negatív Δ 15 NC-D értékekhez vezet, bár a biokémiai mechanizmus továbbra sem tisztázott [38]. Összességében a CSIA elsődleges előnye, hogy a trofikus AA, az AA forrás, az AAESS és az AANESS egyetlen mintából történő mérése lehetővé teszi a fogyasztói fiziológiáról és az ökológiáról szóló több, egymásba fonódó következtetést.

3. CSIA módszerek

3.1. Mintagyűjtés és tárolás

3.2. Kémiai előkészítés az AA izotóp analízishez

1-2 percig vortexelés előtt, majd egy derivatizált AA-t tartalmazó szerves réteg képződik és eltávolítják GC injekcióhoz.

3.3. Kémiai készítmény FA izotóp analízishez

3.4. Egyéni AA és FA izotópos elemzése

1–5 µL) injektálunk egy kis fűtött helyre, ahol magas hőmérsékleten elpárolog egy gázfázisba, majd a minta a GC oszlopba kerül. A GC hőmérsékleti rámpák a monomerek (AA vagy FA) tömeg és polaritás alapján történő elválasztására tervezett protokollt követik. Egyedi AA vagy FA az oszlopról adott időben eluálódik méretük és kémiai tulajdonságaik alapján. Az elemek szétválasztása érdekében a monomereket ezután oxidálják és szén-dioxiddá vagy nitrogénné redukálják, vagy pirolizálják hidrogéngázzá magas hőmérsékletű reaktorban, és ezeket a reakciótermékeket az IRMS-be juttatják. Ezután minden AA-t vagy FA-t feszültségnövekedésként detektálunk, amelyet egy különálló csúcs képvisel a kromatogramon (2. ábra), amelyből az izotóp arányokat számoljuk. Az egyéni AA és FA mindig ugyanabban a sorrendben eluálódik, hacsak a GC hőmérséklet-emelkedési protokollját nem változtatják meg. A végeredmény: δ 13 C, δ 15 N vagy δ 2 H 10–14 AA esetén, vagy δ 13 C több FA esetén (mintatípustól függően), egyetlen minta egyetlen injekciójával. Ez az adatgazdagság annak a fő oka, hogy a CSIA gyorsan hatékony eszközzé válik a fiziológiai és ökológiai vizsgálatok során.