Az N-butil-ftalid enyhíti a vér-agy gát károsodását szénmonoxidnak kitett patkányokban

Mingjun Bi

1 Kínai és nyugati orvoslás integrációs tanszéke, a Qingdao Egyetem Yantai Yuhuangding kórháza, Yantai, Kína

2 Sürgősségi Központ, a Csingtaói Egyetem kapcsolt Yantai Yuhuangding kórháza, Yantai, Kína

Mingwei Zhang

3 a Weifang Orvosi Főiskola Shouguang Népi Kórháza, Weifang, Kína

Dadong Guo

4 Eye Institute of Shandong Hagyományos Kínai Orvostudományi Egyetem, Jinan, Kína

Weikang Bi

5 Klinikai Orvostudományi Tanszék, Qingdao University Medical College, Qingdao, Kína

Bin Liu

6 A Shandong Hagyományos Kínai Orvostudományi Egyetem második klinikai orvosi főiskolája, Jinan, Kína

Yong Zou

1 Kínai és nyugati orvoslás integrációs tanszéke, a Qingdao Egyetem Yantai Yuhuangding kórháza, Yantai, Kína

Qin Li

1 Kínai és nyugati orvoslás integrációs tanszéke, a Qingdao Egyetem Yantai Yuhuangding kórháza, Yantai, Kína

Absztrakt

A szén-monoxid (CO) mérgezés az egyik legfontosabb egészségügyi probléma, és neuropatológiai változásokat és neurológiai következményeket eredményezhet. Kevés tanulmány foglalkozott azonban a CO-mérgezés és a vér-agy gát (BBB) károsodása közötti összefüggéssel. Ebben a tanulmányban az N-butil-ftalid (NBP) hatásait vizsgáltuk a zonula occludens-1 (ZO-1), claudin-5 és aquaporin-4 (AQP-4) fehérjék expressziójára CO-mérgező patkány modellben. Az eredmények azt mutatták, hogy az agy víztartalma nyilvánvalóan megnövekedett, és az endothel sejtek közötti szoros kapcsolódási pontok megszakadtak, ami jelentős agyödémát és BBB diszfunkciót eredményezett a CO mérgezés patkány modelljében. Eközben az endoteliális sejtek és a periciták ultrastruktúrája súlyosan károsodott, és a ZO-1 és a claudin-5 expressziója korai stádiumban csökkent (Kulcsszavak: aquaporin-4, vér – agy gát, claudin-5, CO-mérgezés, N-butil-ftalid, Zonula occludens-1

Bevezetés

Az NBP és fő metabolitjainak kémiai szerkezete in vivo: (A)N-butil-ftalid, (B) az NBP oldalláncának hidroxilezett metabolitja, és (C) az NBP oxidált metabolitja a laktonikus gyűrű nyitott hurkát követően.

Anyagok és metódusok

Kísérleti modell és csoportok

Kezelési beavatkozások

Valamennyi patkányt naponta egyszer hiperbarikus oxigénterápiában szenvedtük az állati oxigénkamrában a CO-expozíció után, amíg le nem vágták. A paraméterek a következők: tiszta oxigén 5 percig, 20 percig fokozva, 0,2 MPa oxigénig 60 percig, végül dekompressziósan 20 percig. Az oxigénkoncentrációt 95 és 99% között tartották az állatkabinban a hiperbarikus oxigénterápia során. Az NBP-t (tételszám: 11040311; tisztaság: 100%; kémiai képlet: C12H14O2, molekulatömeg: 190,24) a Shijiazhuang Pharmaceutical, Co., Ltd, Kína szívesen támogatta. Az NBP + CO csoportba tartozó patkányokat orálisan adtuk be NBP-nek 6 mg/100 g dózisban gyomorcsővel történő szondázással 2 órával a CO-expozíció után a korábbi vizsgálatok szerint (Zhao et al., 2013; Li J. et al., 2015), naponta kétszer az áldozatig, és a CO csoportba és az NC csoportba tartozók ugyanabban az adagban kapták a tiszta olívaolajat, mint a placebo, ugyanakkor.

Az agy víztartalmának meghatározása

A fent leírt beavatkozások után az agy víztartalmát száraz-nedves tömeg módszerrel detektáltuk (Chen et al., 2015). Röviden, mindegyik csoportból négy patkányt lefejeztek az 1., 3., 7. és 14. napon, mély anesztézia után, 3% pentobarbitállal. Ezt követően a teljes agyszöveteket kivették a koponyából, és először lemérték őket (nedves mérés). Száraz tömeget kaptunk elektronikus mérlegen, szárítás után, elektromos kemencében 100 ° C-on 24 órán át. Ezután az agy víztartalmát százalékban számoltuk: az agy víztartalma (%) = [(nedves tömeg - száraz tömeg)/nedves tömeg] × 100%.

Transzmissziós elektronmikroszkópia (TEM) lantán nyomjelzővel

A lantán nyomjelzőt gyakran használják a sejtkapcsolat és a sejtmembrán permeabilitás változásának tanulmányozására az elmúlt években (Kalachev, 2015; Yazama et al., 2015). Ebben a vizsgálatban minden csoportban négy patkányt intraperitoneálisan altattunk meghatározott időpontokban, majd 200 ml 0,9% -os nátrium-kloridot 1 órán át és 250 ml 2% lantán-nitrát-dimetil-arzént perfundáltattunk a bal kamrából 2 órán át. A patkánytest merevsége után az egész agyat kivettük, az agykérget és a hippocampust kraniotómiával izoláltuk. Ezután a szöveteket három, körülbelül 1 mm méretű szektorra vágtuk, és 2 óránál hosszabb ideig folyamatosan rögzítettük egy lantán-nitrát fixálóval. Etanolban és acetonban végzett dehidratálás, majd 2% -os 1% -os ozmium-tetroxid-oldatban történő áztatás után az agyi szektorokat E-pon 812-be ágyazottuk, és 60 ° C-on 48 órán keresztül termikusan polimerizáltuk, végül 90 nm-es specifikus ultravékony szakaszokra vágtuk. Telített uranil-acetát és ólom-citrát kettős festésével a metszeteket rézhálókra (200 mesh) helyeztük, és transzmissziós elektronmikroszkóp alatt (TEM; JEM-100CX2, Japán) figyeltük meg. A BBB permeabilitását és az ultrastrukturális változásokat lantán-nitrát exudációjával értékeltük.

Immunhisztokémiai vizsgálat

Az agyszövetek szekvenciális paraffinszeleteit készítettük az immunhisztokémiai vizsgálathoz. A ZO-1 (katalógusszám: sc-8146) monoklonális antitesteket a Santa Cruz Company-tól vásároltuk. Minden eljárást a gyártó protokolljainak megfelelően hajtottak végre. A ZO-1 antitestet 1: 200-ig hígítottuk. A sejteket barna szemcsés membránban vagy citoplazmában fénymikroszkóp alatt (Leica, Németország) ZO-1 pozitív expressziónak tekintettük. Negatív kontroll tárgylemezekhez 0,01 mmol/l foszfátpufferolt oldatot (PBS) adtunk monoklonális antitest helyett. Négy nem átfedő mezőt véletlenszerűen figyeltünk meg a bal féltekén, és a pozitív sejteket négy mikroszkóp szeletből számítottuk ki mindegyik patkányban fénymikroszkóp alatt. Leica Qwin képfeldolgozó és elemző rendszer segítségével az egyes nézetekben a célfehérje optikai sűrűségének (OD) értékét a negatív kontroll határozta meg és standardizálta (Varghese et al., 2014; Tang et al., 2016).

Immunfluoreszcencia festés

Az AQP-4 (katalógusszám: sc-9887) és a claudin-5 (katalógusszám: sc-17668) monoklonális antitesteket egyaránt a Santa Cruz Company-tól vásároltuk. Minden patkány négy szekvenciális paraffinmetszetét 4% paraformaldehidben rögzítettük 4 ° C-on 15 percig, 2 órán át blokkoltuk a nem-specifikus kötőhelyeket, és primer monoklonális antitestekkel (anti-AQP-4-et hígítottunk 1: 200 arányban PBS-ben, anti-claudin-5 1: 150) 2 órán át 37 ° C-on, fluoreszcens szekunder antitestek 1 órán át 37 ° C-on, végül 50% glicerin hozzáadásával. Az egész folyamatot sötét helyiségben hajtottuk végre, és a tárgylemezeket teljesen PBS-sel mostuk, az előbb leírtak szerint (Lochhead et al., 2010). A pozitív sejteket négy, egymást nem átfedő nézetben figyeltük meg fluoreszcens mikroszkóp alatt (Leica, Németország), és az egyes nézetek OD értékét a Leica Qwin képfeldolgozó és elemző rendszer határozta meg.

A ZO-1 és a claudin-5 közötti helymeghatározás meghatározásához kettős immunfluoreszcencia jelölést alkalmaztunk a jelen tanulmányban. A ZO-1 (SABC-FITC) volt az első színező antitest, a claudin-5 (SABC-CY3) a második a színezés árnyalata szerint. A különböző hullámhosszúságú lézeres gerjesztés és vétel során a ZO-1 (1: 150 arányban hígított) pozitív sejtek sárga-zöld fényben, míg a claudin-5 (1: 150 arányban hígított) pozitív sejtek vörös fényt mutattak 400-szoros fluoreszcens mikroszkóp alatt. A ZO-1 és a claudin-5 pozitív sejteket ugyanabban a nézetben figyeltük meg különböző gerjesztési hullámhosszakkal, és az egyesített képet a photoshop7.0 szoftverrel kaptuk.

Western Blot elemzés

Mindegyik csoportban négy patkányt mélyen altattunk és perfúziót adtunk a megadott időpontokban a fent leírtak szerint. Az agymintákat elválasztottuk és polivinilidén-fluorid membránokra helyeztük (Millipore, Billerica, MA, USA). Miután 10 órán át 10% fölözött tejet tartalmazó Tris-pufferolt sóoldattal és Tween 20 oldattal (TBST) blokkoltuk, a membránokat 30 percig primer antitesttel (ZO-1 hígítás 1: 550, claudin-5 hígítás 1: 500) inkubáltuk., majd torma-peroxidáz (HRP) -konjugált szekunder antitesttel kezeltük 2 órán át szobahőmérsékleten. Ezután a membránokat ezután PBS-sel mostuk, és X optikai filmben fejlesztettük ki a gyártó utasításainak megfelelően. A célfehérje abszorbancia (A) értékét egy Bio-Rad 2000 gél képalkotó rendszerrel és a Quantity one szoftverrel értékeltük, és a β-aktin értékhez viszonyítva normalizáltuk ugyanabban a mintában, mint egy belső referencia. Valamennyi kísérletet három példányban hajtottuk végre.

Statisztikai analízis

Valamennyi kísérletet legalább háromszor megismételtük. Az adatokat átlag ± standard deviációként (SD) fejeztük ki, és a paraméterek különbségeit egyirányú varianciaanalízissel (ANOVA) elemeztük, majd a legkevésbé szignifikáns különbség (LSD) t-tesztet végeztük SPSS 19.0 statisztikai szoftverrel (IBM, Armonk (NY, USA). Valamennyi tesztet statisztikailag szignifikánsnak tekintettük P 2. ábrán , akut CO-expozíció után a CO csoportban a patkányok agyi víztartalma fokozatosan nőtt az 1. napon, a 3. napon tetőzött, majd fokozatosan csökkent. Az NC csoporttal összehasonlítva statisztikailag különbségek voltak ugyanazon időpontokban (P ∗ NC csoporttal összehasonlítva, P # összehasonlítva az CO csoporttal azonos időpontban, P 3. ábra 3 ). Időközben az NBP beadása után a hippocampusban és a kéregben lévő mikrovérek ultrastrukturális károsodása enyhült, és a lantánrészecskéknek csak egy kis része haladt át az érfalon és szivárgott át az agy parenchymájába, amely főleg TJ-kben található az érrendszeri endothelsejtek között, sőt eljutott az alapmembrán. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az NBP csillapíthatja az agyi ödémát, jelentősen javíthatja a BBB működését és az ultrastrukturális integritást.

A vér-agy gát ultraszerkezeti változásai különböző csoportokban. A BBB szerkezete viszonylag ép volt az NC csoportban, és a lantán-nitrát részecskék a mikrohullám falai közé voltak zárva (A1, A2). A vaszkuláris falak szerkezeti integritása azonban súlyosan megsemmisült a CO csoportban, és a lantán-nitrát részecskék behatoltak az érfalakból az agy parenchymájába (B1, B2). Ezzel szemben a mikrovérek ultrastrukturális károsodása nem volt súlyos az NBP kezelési csoportban, a lantánrészecskéknek csak egy kis része haladt át az érfalon és szivárgott az agy parenchymájába (C1, C2). Nyilak: lantán-nitrát részecskék; Bm: bazális membrán; Ec: endothelium sejt; Fp: lábfolyamat; VVT: vörösvérsejt (a skála 1 μm az A1, B1, C1 és 200 nm az A2, B2, C2 esetében; n = 4).

A ZO-1 expressziós szintjei

A ZO-1 és a claudin-5 expressziója ugyanabban a nézetben kettős immunfluoreszcencia jelöléssel. (A) ZO-1 pozitív sejtek; (B) Claudin-5 pozitív sejtek; (C) A ZO-1 és a claudin-5 fehérjék együttes expressziója (összevont kép). A méretarány 30 μm.

A három fehérje expressziós szintje közötti összefüggések tisztázása érdekében lineáris regressziós elemzést végeztünk. Az immunhisztokémia és az immunfluoreszcencia vizsgálat eredményei alapján azt tapasztaltuk, hogy a ZO-1 és a claudin-5 fehérjék expressziós szintje gyorsan csökkent CO-mérgezés után patkányokban. Miután azonban a patkányok ismét oxigénellátást kaptak, expressziójuk folyamatosan növekedett, és a ZO-1 szintje statisztikai elemzéssel szignifikánsan korrelált a claudin-5 szintjével (r = 0,8930, Ábra 9. ábra 9 ). Ez az eredmény összhangban volt a Western blot assay eredményével is. A ZO-1 és a claudin-5 fehérjék expressziós variációival ellentétben az AQP-4 expresszió csak ideiglenesen emelkedett a patkányok CO-mérgezése után, majd fokozatosan ismét csökkent oxigénpótlással. Ez az eredmény kissé eltér a ZO-1 fehérje ingadozásában, és bizonyos mértékig negatív korreláció is fennállhat (r = -0,5864, Ábra 10. ábra 10 ).

A ZO-1 és a claudin-5 fehérje expressziójának kapcsolata. A ZO-1 fehérje szintjének változása hasonló volt a claudin-5éhez, és pozitív korreláció volt a két fehérje között (r = 0,8930, n = 4).

Kapcsolat a ZO-1 és az AQP-4 fehérje expressziók között. Az AQP-4 expresszió kissé eltért a ZO-1 fehérje ingadozásától, és bizonyos mértékig negatív korreláció is fennállhat a két fehérje között (n = 4, r = -0,5864).

Vita

A ZO-1, a claudin 5 és az AQP-4 sematikus ábrája a folyamatos endotheliumban és a CO-mérgezés utáni molekuláris mechanizmus. Fiziológiailag a szűk kereszteződésű komplexek (beleértve a ZO-1, az occludin és a claudin-5 fehérjéket) horgonyoznak az endothel sejtek transzmembrán fehérjéiben (kék jel). Kóros körülmények között, például oxidatív stressz, szabad gyökök, CO-mérgezés, hipoxia és gyulladás, neutrofilek és limfociták indukálják az MMP-k túltermelését és aktiválódását, ami később felgyorsítja a TJ-komplexek lízisét, valamint a ZO-1 és claudin-5 fehérjék, ami a BBB károsodását eredményezi (piros jel).