Az algapoliszacharidok, a laminarin és a fukoidán hatása a vastagbél patológiájára, a citokin gén expressziójára és az Enterobacteriaceae-re egy dextrán-nátrium-szulfáttal fertőzött sertésmodellben

C. J. O'Shea

1 Mezőgazdasági és Élelmiszertudományi Kar, Élettudományi Főiskola, University College Dublin, Belfield, Dublin 4, Ír Köztársaság

J. V. O'Doherty

1 Mezőgazdasági és Élelmiszertudományi Kar, Élettudományi Főiskola, University College Dublin, Belfield, Dublin 4, Ír Köztársaság

J. J. Callanan

2 Állatorvos-tudományi Kar, Élettudományi Főiskola, University College Dublin, Belfield, Dublin 4, Ír Köztársaság

D. Doyle

1 Mezőgazdasági és Élelmiszertudományi Kar, Élettudományi Főiskola, University College Dublin, Belfield, Dublin 4, Ír Köztársaság

K. Thornton

2 Állatorvos-tudományi Kar, Élettudományi Főiskola, University College Dublin, Belfield, Dublin 4, Ír Köztársaság

T. Sweeney

2 Állatorvos-tudományi Kar, Élettudományi Főiskola, University College Dublin, Belfield, Dublin 4, Ír Köztársaság

Absztrakt

Az algar poliszacharidok, a laminarin (LAM) és a fukoidán (FUC), erős gyulladáscsökkentő hatással bírnak a gyomor-bél traktusban. Célunk az volt, hogy megvizsgáljuk a LAM és/vagy FUC korábbi fogyasztásának a patológiára és a gyulladásra gyakorolt hatását sertésekben végzett dextrán-nátrium-szulfát (DSS) hatására. A sertéseket (n 7/csoport) az öt kísérleti csoport egyikébe soroltuk 56 napig. 49–55 napig desztillált vizet vagy DSS-t adtunk intragasztrikusan. A kísérleti csoportok a következők voltak: (1) alapdiéta + desztillált víz (kontroll); (2) alapdiéta + DSS (DSS); (3) bazális étrend + FUC + DSS (FUC + DSS); (4) bazális étrend + LAM + DSS (LAM + DSS); és (5) bazális étrend + LAM + FUC + DSS (LAMFUC + DSS). A DSS csoportban csökkent a testsúlygyarapodás (P Kulcsszavak: Laminarin, Fucoidan, fekélyes vastagbélgyulladás, Dextran-nátrium-szulfát, sertés, citokinek, Enterobacteriaceae

Anyagok és metódusok

Az ebben a vizsgálatban leírt összes kísérleti eljárást az Ír Egészségügyi Minisztérium kísérleti engedélye alapján hajtották végre az 1876-os Állattörvény és az Európai Közösségek (Az állatok kegyetlenségéről szóló törvény 1876-os módosítása) szabályozásának (1994) megfelelően.

Kísérleti tervezés és étrendi összetétel

Állatok és menedzsment

Összesen harmincöt sertést (nagy fehér × (nagy fehér × landrace) kocák utódai), akiknek súlya 7 (sd 0,53) kg volt, az öt kísérleti csoport egyikéhez (n 7 sertés/kísérleti csoport) osztottunk, és egyedileg elhelyeztük őket tollakban (1,7 × 1,2 m). A takarmányt és a vizet ad libitum szolgáltatták. A sertéseket a kísérlet kezdetén (0. nap), a DSS adagolásának kezdetén (49. nap) és az eutanázia napján (56. nap) lemértük, hogy megkapjuk a testsúlyt és kiszámítsuk az átlagos napi testtömeg-változást.

Hasmenési pontszám

Valamennyi sertést egyedileg figyeltük meg a hasmenés klinikai tünetei tekintetében a kísérlet 49. napjától az 56. napig egyetlen kezelőnél, a kísérleti csoportok előzetes ismerete nélkül. Pontozási rendszert alkalmaztak a jelenlét és a súlyosság mértékének jelzésére (, 19). A következő pontozási rendszert alkalmazták: 1 = kemény, kemény széklet; 2 = enyhén lágy széklet; 3 = lágy, részben kialakult széklet; 4 = laza, félig folyékony széklet (hasmenés); és 5 = vizes, nyálkaszerű széklet (súlyos hasmenés).

Takarmány- és hínárkivonat összetételének elemzése

Szérum xilóz, vékonybél és vastagbél hisztopatológiai elemzése

Haematoxylinnel és eozinnal festett proximális vastagbél reprezentatív szakaszai (nagyítás × 10), amelyek demonstrálják a patológia spektrumát. (a) Egészséges szövet, (b) egészséges, redukált lamina proprial sejt infiltrátummal, (c), intakt hám által határolt fokális fekély, (d) diffúz fekély. A bemutatott szövettan reprezentatív a vastagbél szöveteinek vizsgálatához, mind az öt malaccsoportban (n 7 csoportonként).

Proximális vastagbél génexpresszió

Mikrobiológia

A mikrobiális genomi DNS-t QIAamp DNS székletkészlettel (Qiagen) nyertük ki a proximális vastagbél digesta-ból a gyártó utasításainak megfelelően. A DNS mennyiségét és minőségét Nanodrop (Thermo Scientific) alkalmazásával értékeltük. A digesta mikrobiális DNS összesített aliquotjából standard görbéket készítettünk, és a vastagbél Enterobacteriaceae abszolút számának becslésére használtuk a gén kópiaszám alapján (, 27). A kvantitatív valós idejű PCR vizsgálathoz az Enterobacteriaceae 16 s rRNS génre specifikus oligonukleotid primereket használtunk (5-ös - 3 ′ CATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGC és reverz primer 5 - 3 - CTCTACGAGACTCAAGCTTGC - primerek (28). Valós idejű PCR-t ABI 7500 valós idejű PCR rendszerrel (Applied Biosystems) végeztünk 20 µl végső reakciótérfogatban, amely 1 µl templát DNS-t, 1 µl előre és reverz primereket (100 pm), 10 µl SYBR Green PCR-t tartalmazott. Master Mix (Applied Biosystems) és 8 µl nukleázmentes víz. A termikus ciklus körülményei között volt egy kezdeti denaturálási lépés 95 ° C-on 10 percig, majd negyven 95 ° C-os ciklus 15 másodpercig és 65 ° C-on 1 percig. A PCR termék disszociációs görbéjének elemzése megerősítette a vizsgálat specifitását. Az egyes minták három példányából származó átlagos küszöbértéket használtuk a számításokhoz.

Statisztikai analízis

LAMFUC, laminarin + fukoidán; NS, P ≥ 0,05.

* P † Előre tervezett kontrasztok a P értékkel összehasonlítás céljából: kontraszt 1 = DSS v. Kontroll; kontraszt 2 = FUC + DSS v. DSS; kontraszt 3 = LAM + DSS v. DSS; kontraszt 4 = LAMFUC + DSS v. DSS.

LAMFUC, laminarin + fukoidán; NS, P ≥ 0,05.

* P † Előre megtervezett kontrasztok a P értékkel összehasonlítás céljából: kontraszt 1 = DSS v. Kontroll; kontraszt 2 = FUC + DSS v. DSS; kontraszt 3 = LAM + DSS v. DSS; kontraszt 4 = LAMFUC + DSS v. DSS.

Enterobacteriaceae a proximális vastagbél digesta-ban

A proximális vastagbélben a DSS csoport növelte az Enterobacteriaceae 16 s rRNS gén kópiaszámát (P 2. táblázat). A LAM + DSS csoportban csökkent az Enterobacteriaceae mennyisége (P 3. táblázat. A végső testtömeg (56. nap) negatívan kapcsolódott a proximális vastagbél patológiájának pontszámához (r −0 · 58; P † ‡

A kiválasztott gyulladásos markerek proximális vastagbél gén expressziója Patológiai pontszámIL-8IL-6IL-1βIL-17ATGF-βTNF-αIL-10 Proximális vastagbél Disztális vastagbél

Végső testtömeg	−0 · 18	−0 · 48 *	−0 · 52 **	−0 · 39 *	−0 · 19	−0 · 43 *	−0 · 15	−0 · 58 ***	−0 · 43 *
Testtömeg-növekedés	−0 · 23	−0 · 62 ***	−0 · 49 *	−0 · 34	−0 · 27	−0 · 29	−0 · 15	−0 · 75 ***	−0 · 74 ***
Patológiai pontszám (proximális vastagbél)	0 · 41 *	0 · 86 ***	0 · 58 ***	0 · 38 *	0 · 48 **	0 · 56 **	0 · 52 **	0 · 77 ***

Jelentős korrelációs együtthatók: * P † Spearman-féle rang-korrelációs együtthatókat használtunk a patológiai pontszám és más változók közötti statisztikai függőség meghatározásához, valamint Pearson-féle korrelációkat a testtömeg és a citokin adatok közötti összefüggésekhez.

Vita

Ebben a tanulmányban DSS-kihívási helyzetben a sertéseknek csökkent a testsúlygyarapodásuk és hasmenésük volt. Ehhez társult a proximális vastagbélben az UC szövettani kórtani bizonyítéka, a pro-gyulladásos citokin génexpresszió növekedése és az Enterobacteriaceae luminalis bőségének növekedése. Korábban a LAM és FUC algapoliszacharidokról kiderült, hogy gyulladáscsökkentő és gátló hatást mutatnak az Enterobacteriaceae-re (, 11, 12, 30), és itt vizsgálták őket a DSS-provokációs periódus hatásainak enyhítésében játszott lehetséges szerepük miatt. disznókban. A FUC és/vagy LAM korábbi fogyasztása javította a DSS-provokációval járó hasmenés pontszámát, jelezve a védőhatást. Ezeket a hatásokat a proinflammatorikus citokin IL-6 mRNS-gén expressziójának csökkenése kísérte a proximális vastagbélszövetben. Ezenkívül a LAM előzetes fogyasztása önmagában csökkentette az Enterobacteriaceae mennyiségét a proximális vastagbélben, amelyhez DSS-fertőzés társult.

Az UC kialakulása gyakran súlycsökkenéssel jár együtt, az inappetencia, a tápanyagok felszívódási zavarának, valamint a hasmenés következtében bekövetkező folyadék- és elektrolitveszteség kombinációjának köszönhetően (, 3, 31). A DSS-csoport végső testsúlya körülbelül 11% -kal kisebb volt, mint a kontrollcsoporté a kísérlet végén, ami a testtömeg-növekedés 30% -os csökkenését tükrözi a 7 napos DSS-kezelési periódus alatt. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a LAM-ot és FUC-t tartalmazó hínárkivonat étrendi bevitele javíthatja a testtömeg-növekedést az újonnan elválasztott malacokban, amelyek gyakran átmeneti vastagbélgyulladáson mennek keresztül az étrendi változások okozta stressz miatt (, 13, 14). Jelen eredmények azt mutatják, hogy a LAMFUC + DSS csoportnak nagyobb volt a végső testtömege a kísérlet végén a DSS csoporthoz képest, ami a DSS-kihívással járó fogyás enyhülését jelzi. Míg azonban az FUC + DSS csoport javította a súlygyarapodást, sem ez a csoport, sem a LAM + DSS csoport nem különbözött a DSS csoporttól, ami arra utal, hogy a tengeri moszat poliszacharid kivonatai kombinációban hatékonyabbak a testtömeg megőrzésében.

Míg a hasmenés a veleszületett immunrendszer fontos eleme, megkönnyíti a kórokozók kiürülését a vastagbél hámjából (, 32, 33), UC-ben korlátozott értéke van, a kimerült folyadékok és elektrolitok révén gyengíti a gazdát. Ebben a vizsgálatban a DSS-csoport hasmenést kapott a DSS 7 napos beadását követően. Érdekes módon a LAM-ot és az FUC-t tartalmazó kísérleti csoportok önmagukban és együttesen csökkentették a DSS-kihívással járó hasmenés súlyosságát. Ezek közül az FUC + DSS csoport mutatta a legnagyobb mértékben a hasmenést a DSS csoporthoz képest. Egy korábbi tanulmányban Zhang és mtsai. (, 34) kimutatta, hogy a FUC intravénás beadása enyhítette a nyálkahártya károsodását egér colitis modellben. Ezeknek a hínárkivonatoknak és különösen a FUC-nak a hasmenés enyhítésében betöltött szerepe további vizsgálatokat igényel, tekintettel arra, hogy a tartós hasmenés hozzájárul az UC-ben szenvedő betegek egészségügyi terheléséhez (, 35) .

Az UC-ben a patológia jellemzően az ileocaecalis szelep és a végbél között fordul elő. Előfordulhat azonban valamilyen kapcsolat a disztális ileummal, és az ilyen ileitis a nyálkahártya erózióját és az elakadt villusokat (36) eredményezi, ami hozzájárul a tápanyagok felszívódási zavarához és a fogyáshoz (3, 37). Ebben a vizsgálatban a DSS csoport ileumában a kontroll csoporthoz képest nem volt megfigyelhető villus dystrophia; azonban az előbbiek szérum xilózkoncentrációja alacsonyabb volt az utóbbihoz képest, ami a vékonybél xilóz felszívódásának bizonyos fokára utal (38). Ezért, bár a DSS által kiváltott gyulladás a vastagbélben lokalizálódott, az ileum funkciója veszélybe kerülhetett a DSS mérsékelt súlyosbodása miatt (, 39). Nemrégiben megmutattuk, hogy a LAM-ban és FUC-ban gazdag tengeri moszat-kivonatok javítják a tápanyagok emészthetőségét az elválasztási stresszben szenvedő sertésekben (, 13), valószínűleg a monoszacharid-transzportban részt vevő gének felfelé irányuló szabályozása miatt (, 40). A jelen vizsgálatban azonban az összes alga kivonatot kapott DSS csoport szérum xilózkoncentrációja magasabb volt, de nem különbözött a kontroll és a DSS csoportok között.

Az enterális mikrobiota szerepe nagy figyelmet keltett az UC-betegek profiljában a különféle baktérium-taxonómiai rétegekben rejlő eredendő különbségek miatt, összehasonlítva az egészséges tesztalanyokkal (, 49). Például több bizonyíték van a Gram-negatív baktériumok megnövekedett mennyiségére az UC-ben szenvedő betegeknél néhány tanulmányban (, 50), beleértve az Enterobacteriaceae-t is, amelyek a betegség súlyosságával társultak (, 51). Ebben a tanulmányban a DSS-csoportban a proximális vastagbélben a kontroll csoporthoz képest 1-szeres növekedés mutatkozott az Enterobacteriaceae-ban, párhuzamosan az Enterobacteriaceae és a klinikai kutatások során megfigyelt UC-vel. Korábban kimutatták, hogy a LAM és az FUC módosíthatja a bélben lévő mikrobiota profilját, beleértve az Enterobacteriaceae mennyiségének csökkentését a sertés vastagbél digestájában (, 8, 20). A LAM + DSS csoportban csökkent az Enterobacteriaceae mennyisége a DSS csoporthoz képest, ami a kontroll csoporthoz hasonló szinten volt. Ennek a hatásnak a jelentősége abban a kontextusban, hogy a LAM hogyan mérsékelte a DSS-kihívással összefüggő más mért változókat a jelen tanulmányban, nem egyértelmű, de fontos lehet, tekintettel az Enterobacteriaceae szerepére a gyulladásos bélbetegségben.

Összefoglalva: a sertés DSS-kiváltása csökkent testtömeggel, hasmenéssel és a gyulladásgátló IL-6 citokin növekedésével, valamint a vastagbél digestájában az Enterobacteriaceae bőségével társult. E tanulmány megállapításai azt mutatják, hogy az FUC-t, valamint a FUC és LAM kombinációját tartalmazó étrend előzetes expozíciója javította a súlycsökkenést, a hasmenést, de nem javította a sertések proximális vastagbélében a DSS-provokációhoz kapcsolódó patológiai pontszámot. Erős összefüggést figyeltek meg az IL-6 nyálkahártya mRNS-bősége és a proximális vastagbél patológiájának súlyossága között. Érdekes módon azok a kísérleti csoportok, amelyek mind a LAM-ot, mind a FUC-t kapták a DSS-fertőzés megkezdése előtt, csökkent IL-6 mRNS-bőséget mutattak ki, ami alátámaszthatja az algák poliszacharidjainak DSS-kihívással szembeni védőhatását. Ezenkívül a LAM + DSS csoportban csökkent volt az Enterobacteriaceae mennyisége, amely egy DSS-kihívással társult. Az adatok együttesen azt sugallják, hogy a LAM és a FUC korábbi fogyasztása bizonyítékot szolgáltat ezen algapoliszacharidok lehetséges szerepére az UC táplálkozási terápiájában. További kutatások szükségesek az UC-vel összefüggő patológia kialakulása elleni hatékony védelem képességének megállapításához.

Köszönetnyilvánítás

A szerzők köszönetet mondanak B. Flynnnek, A. Walsh-nak, M. Ryan-nek, P. Reilly-nek és D. Cunninghamnek a technikai segítségért.

Ezt a tanulmányt az Enterprise Ireland és a BioAtlantis Limited finanszírozta az Innovációs Partnerség Program keretében. Sem az Enterprise Ireland, sem a BioAtlantis Limited nem játszott szerepet a jelen tanulmány megtervezésében és elemzésében, illetve a cikk megírásában.

C. J. O. S., J. V. O. D., J. J. C. és T. S. tervezték a kutatást; C. J. O. S., J. V. O. D., J. J. C., K. T. és D. D. végezték a kutatást és elemezték az adatokat; és C. J. O. S., J. V. O. D., J. J. C. és T. S. írták a kéziratot. Minden szerző elolvasta és jóváhagyta a végleges kéziratot.