Az aktivinreceptor-szerű kináz 7 elnyomja a lipolízist, hogy felhalmozódjon a zsír az elhízásban, a peroxiszóma proliferátor-aktivált receptor γ és C/EBPα visszaszorításával.

Absztrakt

A legutóbbi, genom egészére kiterjedő asszociációs vizsgálatok emberi populációkban több olyan gént azonosítottak, amelyek összefüggenek a gyakori poligénes betegségekkel, beleértve a 2-es típusú cukorbetegséget és az elhízást (1 Belső technikai korlátaik miatt azonban ezek a tanulmányok csak viszonylag kis hatásméretű, de nem ritka, nagy hatásméretű variánsokat tudnak azonosítani. Az emberi vizsgálatokkal ellentétben az állatok poligénes betegségmodelljeiben végzett genetikai keresztezések lehetővé teszik a kvantitatív tulajdonság lokuszok (QTL) feltérképezését, és a specifikus kromoszóma szegmenst hordozó kongén törzsek felépítése könnyen összekapcsolhatja a kötés egyensúlyhiányon alapuló asszociációját a felelős gén. Az állati poligén megbetegedésekben a fő hatásokkal járó genetikai változások azonosítása elmélyíti az emberi patofiziológia megértését, akárcsak az állati monogén betegségek okozati génjeinek felfedezése (2–4). Az ilyen vizsgálatok azonban idő- és munkaigényesek, és kevesen mutatták be a tényleges génváltozásokat.

Korábban azonosítottuk az inzulinfüggő 5-ös cukorbetegséget (Nidd5) az egér 2. kromoszómáján, amely az adipozitást a Tsumura, Suzuki, Elhízott Diabétesz (TSOD) egerek és a kontroll BALB/cA (BALB) egerek genetikai keresztezésével befolyásolja (5). Ezután generáltunk ehhez a QTL-hez kongén törzseket, és jellemeztük fenotípusaikat annak fizikai meghatározásához (6). A jelenlegi vizsgálatban bebizonyítottuk, hogy az Acvr1c gén nonszensz mutációja, amely az aktivin receptor-szerű kináz 7-et (ALK7) kódolja, csökkenti az adipozitást. Az ALK7-hiány szabályozza a peroxiszóma-proliferátor-aktivált receptor γ (PPARγ) és a CCAAT/enhancer-kötő fehérje (C/EBP) α-t, és elősegíti a lipolízist azáltal, hogy növeli a zsír-lipázok expresszióját, ami a zsír felhalmozódásának nettó csökkenéséhez vezet. Meglepő módon a PPARγ és a C/EBPα összegesen csökkenti a triglicerid (TG) tartalmát az érett zsírsejtekben, bár mind a TG szintézist, mind a lebontást elősegítik. Ezenkívül az elhízott állapot ALK7-hiánya javítja az elhízás okozta glükóz-intoleranciát és inzulinrezisztenciát in vivo. Ezek a megállapítások azt sugallják, hogy a PPARγ és a C/EBPα lipid-mobilizáló szerepet játszik az érett adipocytákban, és az ALK7 jelátviteli útra mutatnak, mint az elhízás terápiájának lehetséges célpontjára.

KUTATÁSI TERVEZÉS ÉS MÓDSZEREK

Állati eljárások.

Minden állatkísérletet a Gunma Egyetem Állatgondozási és Kísérleti Bizottságának szabályai és előírásai szerint hajtottak végre. Az egerek ad libitum hozzáférést kaptak a vízhez és a szokásos laboratóriumi chow-hoz (CE-2; CLEA Japan) egy légkondicionált szobában, 12 órás világos/sötét ciklusokkal. A magas zsírtartalmú étrend (HFD) összetétele 55% zsír, 28% szénhidrát és 17% fehérje volt (kalóriaszázalék; keleti élesztő). A TSOD egeret eredetileg beltenyésztett törzsként hízással és vizeletcukorral hozták létre (7). A BALB és C57BL/6N egereket a CLEA Japan cégtől vásároltuk. A Nidd5-re vonatkozó kongén egér törzsek kifejlesztését máshol írták le (6). A genotipizálást az 1. kiegészítő táblázatban felsorolt primerek alkalmazásával végeztük. Ebben a vizsgálatban csak hím egereket jellemeztünk fenotípusosan. Vérmintákat gyűjtöttünk a farokérből. A nem észterezett zsírsav (NEFA) és a glicerin szérumszintjét NEFA C-teszttel (Wako) és Free Glycerol Assay Kit-rel (BioVision) mértük. Az oxigénfogyasztást és a CO2-termelést Oxymax rendszerrel (Columbus Instruments) mértük.

Adipocita izoláció.

Az epididymális zsírt kivágtuk, ledaráltuk és 1 mg/ml I típusú kollagenázzal (Invitrogen) emésztettük 30 percig 37 ° C-on rázás közben. A sejteket 250 μm-es nejlonhálón átszűrjük, és 50xg-vel 10 percig centrifugáljuk. Az úszó zsírsejteket kétszer mostuk PBS-sel. A stroma-vascularis frakciót (SVF) tartalmazó pelletet 40 μm-es nejlonhálón átszűrjük és eritrocita-lizáló pufferrel (155 mmol/l NH4Cl, 5,7 mmol/l K2HPO4 és 0,1 mmol/l EDTA) inkubáljuk szobahőmérsékleten. 5 percig, majd kétszer PBS-sel mossuk. Az immunblotoláshoz és az immunprecipitációhoz a sejteket pufferrel (20 mmol/l HEPES (pH 7,4), 150 mmol/l NaCl, 1% Triton X-100, 0,2 mmol/l EDTA és 1 mmol/l ditiotreitol) lizáltuk proteázt és foszfatáz inhibitorok. A lipid metabolikus vizsgálatokhoz minden egér törzsből azonos számú frissen izolált adipocitát használtunk.

Sejtkultúra.

Egy 3T3-L1 sejtvonalat, amely stabilan expresszálja a coxsackie-adenovírus receptort (CAR) az adenovírus felvételének megkönnyítése érdekében (8), 10% borjúszérumot tartalmazó Dulbecco módosított Eagle táptalajban tenyésztettünk. Az érett adipocitákba történő differenciálódás kiváltása érdekében az összefolyó sejteket (0. nap) 10% FBS-t tartalmazó táptalajra váltjuk, 5 μg/ml inzulinnal, 0,5 mmol/L 3-izobutil-1-metilxantinnal és 0,25 μmol/L dexametazonnal kiegészítve. 2 napig, majd 5 μg/ml inzulinnal 2 napig.

Kvantitatív PCR elemzések.

A teljes RNS-t reverz átírással oligo- (dT) 12–18 primer és Superscript III (Invitrogen) alkalmazásával írtuk le. Ezután a PCR-t SYBR premix Ex Taq-val (Takara Bio) végeztük. Az eredményeket normalizáltuk a ribosomális fehérje 36B4 mRNS expressziójával szemben. A primer szekvenciákat a 2. kiegészítő táblázat tartalmazza.

Vektor építése.

Az ALK7, Smads, PPARγ2 és C/EBPα teljes hosszúságú cDNS-jeit reverz transzkripcióval írtuk át az egér epididimális vagy 3T3-L1 adipociták RNS-jéről, és szubklónoztuk a pcOH-terminális hemagglutinin-tag vagy COOH-terminálist tartalmazó PCDNA3 vektorba (Invitrogen) három tandem FLAG címke. Az összes mutánst PCR-alapú mutagenezis stratégia alkalmazásával állítottuk elő. A rövid hajtű RNS-eket (shRNS-eket) a BLOCK-iT Adenoviral RNAi Expression System (Invitrogen) szerint terveztük. A primer szekvenciákat a 3. kiegészítő táblázat tartalmazza.

Lipidvizsgálatok.

A [14C] palmitát beépülését a TG-be a korábban leírtak szerint mértük (9). Röviden, az izolált adipocitákat 37 ° C-on inkubáltuk 2 órán át Krebs-Ringer-HEPES pufferben, amely 1% zsírsav (FA) mentes BSA-t és 0,2 μCi/ml [1-14 C] palmitinsavat (PerkinElmer) tartalmazott. A lipolízist a glicerin koncentrációjának mérésével értékeltük. Az adipocitákat 3 órán át 37 ° C-on inkubáltuk 2 mmol/l glükózt és 1% FA-mentes BSA-t tartalmazó Krebs-Ringer-HEPES pufferben 10 μmol/l izoproterenollal vagy anélkül (Sigma-Aldrich). A sejtlizátumok TG-koncentrációját TG Quantification Kit (BioVision) segítségével mértük és normalizáltuk a fehérjekoncentrációra. A máj TG-tartalmát a korábban leírtak szerint mértük (10).

Luciferáz riportervizsgálat.

A CAR – 3T3-L1 adipocitákat (6. nap) a jelzett génpromótert és a pGL4.74 [hRluc/TK] (Promega) kontroll plazmidot tartalmazó riporter plazmiddal transzfektáltuk. 5 órával a transztrekció után a sejteket adenovírussal fertőztük, és további 43 órán át inkubáltuk. A luciferáz aktivitásokat a Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) segítségével mértük. A primer szekvenciákat a 4. kiegészítő táblázat tartalmazza.

Chromatin immunprecipitációs vizsgálat.

Ezt ChIP Assay Kit (Millipore) segítségével hajtottuk végre. A kicsapódott és az input DNS-eket kvantitatív PCR-rel vizsgáltuk az 5. kiegészítő táblázatban felsorolt primerek alkalmazásával.

Inzulinszekréciós vizsgálat.

Tíz, a korábban leírtak szerint izolált (11) szigetet (11) először 37 ° C-on inkubáltunk 30 percig 0,1% BSA-t és 2,8 mmol/l glükózt tartalmazó Krebs-Ringer-HEPES pufferben, majd további 30 percig ugyanabban a pufferben, amely 16,7 mmol volt./L glükóz. Az egyes pufferekben szekretált vagy a sejtekben maradt inzulint AlphaLISA inzulinkészlettel mértük, EnVision 2101 többcímkés leolvasóval (PerkinElmer).

Antitestek.

Nyúl poliklonális antitestet hoztak létre az ALK7 fehérje COOH-terminális régiója (230–493 aminosav) felé, és affinitást tisztítottak a teljes szérumból a nitrocellulóz csíkra immobilizált antigén fehérje segítségével. Egyéb kereskedelemben kapható antitesteket a 6. kiegészítő táblázat sorol fel.

statisztikai elemzések.

A statisztikai szignifikanciát kétfarkú Student t teszttel vagy egyirányú ANOVA alkalmazásával, Tukey többszörös összehasonlító teszttel határoztuk meg.