A szemaforin3E elleni vakcina enyhíti a szisztémás glükóz intoleranciát diétás elhízással rendelkező egerekben

Tárgyak

Absztrakt

Bevezetés

Eredmények

A Sema3E-vakcina gátolja a zsigeri zsírgyulladás gyulladását

A Sema3E vakcina javítja a szisztémás glükóz intoleranciát

Általánosan elfogadott, hogy a zsigeri zsírszövet krónikus steril gyulladása ok-okozati szerepet játszik a szisztémás metabolikus diszfunkció kiváltásában 1,2. Ezért teszteltük a Sema3E vakcina hatását a szisztémás anyagcserére diétás elhízással rendelkező egerekben. Megállapítottuk, hogy a kontrollcsoport és a Sema3E vakcinacsoport között nem volt különbség a táplálékbevitel (2A. Ábra), a testtömeg (2B. Ábra), az eWAT tömeg (2C. Ábra) és a zsigeri zsírtérfogat tekintetében, amelyet CT-vel értékeltek. (2D. Ábra). A metabolikus ketrecben végzett vizsgálatok azt mutatták, hogy az oxigénfogyasztás (VO2), a CO2 termelés (VCO2), a légzéscsere arány (RER) és az energiafelhasználás (EE) összehasonlítható volt a kontrollcsoport és a Sema3E vakcinacsoport között (2E. Ábra). A szisztémás glükóz tolerancia azonban jobb volt a Sema3E vakcina csoportban a glükóz tolerancia teszt alapján (2F. Ábra), ami azt jelzi, hogy a vakcina javította a szisztémás anyagcsere egészségét, valamint elnyomta a gyulladást a zsigeri WAT-ban.

A Sema3E-vakcinával szembeni immunválasz jellemzése

A Sema3E vakcinával szembeni potenciális immunválasz vizsgálatához elemeztük a keringő immunsejteket, de nem találtunk különbséget a csoportok között (3A, B ábra). Az enzimhez kapcsolt immunfolt (ELISpot) tesztet a Sema3E vakcina csoportból származó lépsejtek felhasználásával végeztük a T-sejtek reaktivitásának jellemzésére. A KLH-val végzett kezelés a lépsejtek IL-4 vagy IFN-y termelésének növekedését eredményezte, míg a rekombináns Sema3E fehérje nem volt hatással ebben a tesztben (3C. Ábra, D). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a KLH tartalmaz T-sejtek epitópjait, amint arról korábban 5 beszámoltunk, míg a Sema3E fehérje nem váltott ki immunválaszt a beoltott egerekből gyűjtött T-sejtekből. Ezek az eredmények együttesen azt sugallják, hogy a Sema3E elleni peptid vakcina a jövőben potenciálisan terápiás lehetőséggé válhat a cukorbetegség és/vagy az egészségtelen elhízás szempontjából.

Vita

Anyagok és metódusok

A vakcina megtervezése és szintézise

A Sema3E semlegesítő antitestjeinek előállításához két antigén peptidszekvenciát (a Sema3E 385–394 és 359–368 aminosavakat átívelő) választottak ki a korábbi jelentések alapján (Pang Z, et al. 5.) Az egyes jelölt peptidek N-terminálisát vagy lizinjét glutáraldehiden keresztül konjugáltuk a kulcslyuk végtagi hemocianinnal (KLH), és a szintetikus peptideket fordított fázisú nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (> 99% -os tisztaságú) tisztítottuk (Peptide Institute Inc., Oszaka, Japán), amint azt korábban leírtuk 6 .

Állatmodellek

Valamennyi állatkísérletet a Niigata Egyetem Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottsága által felülvizsgált és a Niigata Egyetem elnöke által jóváhagyott protokollnak megfelelően hajtották végre. A C57BL/6NCr egereket az SLC Japan-tól (Shizuoka, Japán) vásároltuk, és 4-20 hetes korukig magas zsírtartalmú étrendet (HFD) (CLEA Japan, Tokió, Japán) vagy normál chow-t tápláltunk. Mindegyik KLH-konjugált antigén peptidet (20 µg) és azonos mennyiségű teljes vagy hiányos Freund-adjuvánst (Sigma-Aldrich: F5881 (teljes) vagy F5506 (hiányos)) vortexeléssel emulgeáltunk. Az immunizáláshoz az egereket szubkután injekcióval injekciózták a KLH-konjugált peptiddel 6 hetes korban (teljes Freund-adjuvánssal), 10 hetes (hiányos Freund-adjuvánssal) és 14 hetes korban (hiányos Freund-adjuvánssal). A kontrollcsoportok azonos mennyiségű KLH-t kaptak Freund teljes vagy hiányos adjuvánsával keverve. Az antitest-titerek elemzéséhez minden egér farokvénájából plazmát gyűjtöttünk.

Antitest titer mérése

Az egyes peptidek injektálásával keletkezett antitest-titeret ELISA-val mértük. 96 lyukú mikrotiterlemezt (Nunc-Immuno MicroWell 96 üreges szilárd lemez, Thermo Scientific) borítottunk a szarvasmarha szérumalbuminhoz (BSA) konjugált antigén peptidek egyikével karbonátpufferben. Bevonás után az immunizált egerekből összegyűjtött plazmát a lyukakhoz adtuk, és egy éjszakán át inkubáltuk. Ezután a lemezt inkubáltuk a szekunder antitesttel (ECL Anti-egér IgG, torma-peroxidázhoz kötött egész juh antitest, GE Healthcare). A TMB szubsztráttal (Sigma-Aldrich, T0440) történő reakció után az optikai sűrűséget 450 nm-en (OD450) mértük mikrotiter lemezolvasóval (iMark mikrolemez-olvasó, Bio-Rad).

Fiziológiai elemzések

Az egereket egyedileg helyezték el testtömegük és táplálékfelvételük ellenőrzésére. Az adipozitást CT szkenneléssel (LaTheta, Aloca) vizsgálták a gyártó protokollja szerint. CT-felvételeket kaptunk 2 mm-es időközönként a rekeszizomtól a hasüreg tövéig. Az oxigénfogyasztást 20 hetes egerekben mértük O2/CO2 metabolikus mérőrendszerrel (Columbus Instruments) a gyártó utasításai szerint.

Laboratóriumi tesztek

Az intraperitoneális glükóztolerancia tesztet (IGTT) a korábbiakban leírtak szerint végeztük el, kis módosításokkal, és a glükózt intraperitoneálisan adtuk 1 g kg -1 (testtömeg) adagban 4. Az immunizált egerek perifériás fehérvérsejtjeit az Oriental Yeast Co. (Tokió, Japán) számlálta.

Szövettani elemzések és immunfestés

Az epididymális fehér zsírszövet (WAT) mintáit összegyűjtöttük, egy éjszakán át 10% -os formalinban rögzítettük, paraffinba ágyazottuk, és immunfluoreszcenciára vagy hematoxilin-eozinnal (HE) festettük. A reaktív oxigénfajok (ROS) festését a korábbiakban leírt 4,7 módszer szerint végeztük. Az immunfestéshez a para-xinmentesített metszeteket citrátpufferrel kaptuk meg, és anti-PlexinD1 antitesttel (Abcam, ab28762) inkubáltuk 1:50 hígítás mellett. Szekunder antitestként anti-kecske IgG Cy5-konjugátumot (Abcam, ab6566) használtunk. A metszeteket búzacsíra agglutininnel, Alexa Fluor 488 konjugátummal (Invitrogen, W11261, 1:10) és Hoechst (Life Technologies, 33258, 1: 1000) festettük, és egy Biorevo-val (Keyence Co., Oszaka, Japán) fényképeztük.

RNS elemzés

Az RNS és a valós idejű PCR (qPCR) kivonását az előzőekben leírtak szerint hajtottuk végre a következő primerek alkalmazásával. Rplp0 belső kontrollként használták.

Adgre1: GGAGGACTTCTCCAAGCCTATT, AGGCCTCTCAGACTTCTGCTT

Ccl2: CATCCACGTGTTGGCTCA, GATCATCTTGCTGGTGAATGAGT

Cd4: ACACACCTGTGCAAGAAGCA, GCTCTTGTTGGTTGGGAATC

Cd8: CTCACCTGTGCACCCTACC, ATCCGGTCCCCTTCACTG

Cd19: AAGGTCATTGCAAGGTCAGC, CTGGGACTATCCATCCACCA

Cd335: ACACTACTCATCACAGGAGGTGTT, GTTGAAAGGTCAAACTCCCAAT

Cdkn1a: TCCACAGCGATATCCAGACA, GGACATCACCAGGATTGGAC

Itgam: CAATAGCCAGCCTCAGTGC, GAGCCCAGGGGAGAAGTG

Itgax: ATGGAGCCTCAAGACAGGAC, GGATCTGGGATGCTGAAATC

Ly6g: GGCTCAGAAAAGTGCACCA, CGTACGTGGAAGCGAACAG

Plxnd1: CTGGATGTCCATCTGCATGT, CAGGAAGAACGGCTCACCTA

Rplp0: GATGCCCAGGGAAGACAG, ACAATGAAGCATTTTGGATAA.

Western blot elemzés

Western-blot-analízist a korábban leírtak szerint végeztünk 4. Az elsődleges antitestek anti-p53 (1C12) antitestek (Cell Signaling, # 2524) és anti-aktin antitestek (Cell Signaling, # 4970) voltak, amelyeket 1: 1000 hígításban használtunk. Az egér plazma western blot analíziséhez a rekombináns teljes hosszúságú egér Sema3E fehérjét (R&D, 3238-S3) és a BSA-val konjugált antigén peptidet pufferben (10 mM Tris-HCl, pH 7,8, 150 mM NaCl, 1 mM) oldottuk fel. EDTA) és SDS-PAGE-nak vetjük alá. A membránt inkubáltuk az antigén peptiddel vagy KLH-val (1: 200 hígítással) immunizált egerekből vagy anti-Sema3E antitesttel (Santa Cruz, sc-49733) (1: 1000 hígítás) mint elsődleges antitestet, majd a inkubáció torma-peroxidázzal konjugált anti-egér immunglobulin G-vel (Jackson Immunoresearch, # 115-035-003) vagy kecske-ellenes immunoglobulin G-vel (Jackson Immunoresearch, # 705-035-003).

ELISPOT assay

Az INF-γ és IL-4 ELISPOT vizsgálatait egér IFN-y ELISpot PLUS és egér IL-4 ELISpot PLUS (MABTECH Inc., 3321-4HST-2 IFN-y és 3311-4HPW-2 IL-4) alkalmazásával végeztük. a gyártó utasításai szerint. Röviden, immunizált egerekből származó splenocita szuszpenziókat adtunk a 96 üreges ELISpot vizsgálati lemezekhez (106 sejt/üreg), és 10 μg/ml rekombináns egér Sema3E fehérjével (R&D, 3238-S3), 10 μg/ml KLH-val (WAKO) stimuláltuk. Vagy PBS (Con) 37 ° C-on 48 órán át. A lemezeket PBS-sel mostuk és biotinnal konjugált detektáló antitestekkel inkubáltuk 2 órán át szobahőmérsékleten. Mosás után a lemezeket HRP-konjugált sztreptoavidinnal inkubáltuk 1 órán át szobahőmérsékleten, majd inkubálták TMB szubsztráttal. A színes foltokat boncoló mikroszkóppal fényképeztük, és az ImageJ szoftver segítségével megszámoltuk.

Statisztikai analízis

A statisztikai elemzést SPSS szoftverrel (20. verzió) végeztük. Az eredményeket átlag ± SEM-ként mutatjuk be. A kiugró értékeket boxplot elemzéssel kizártuk. A csoportok közötti különbségeket a kétfarkú Student's vizsgálta t-teszt, ismételt intézkedésekkel időbeli vizsgálatokhoz (glükóz tolerancia teszt), vagy 2-utas ANOVA, majd Tukey többszörös összehasonlító tesztje. Minden elemzésben, P

Hivatkozások

Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S. és Spiegelman, B. M. A tumor nekrózis-faktor alfa zsír expressziója: közvetlen szerep az elhízáshoz kötött inzulinrezisztenciában. Tudomány 259, 87–91 (1993).

Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J. és Walsh, K. Adipokinek gyulladásban és metabolikus betegségben. Nat Rev Immunol 11., 85–97 (2011).

Minamino, T. et al. A p53 zsírszövet döntő szerepe az inzulinrezisztencia szabályozásában. Nat Med 15, 1082–1087 (2009).

Shimizu, én. et al. A szemaforin3E által kiváltott gyulladás hozzájárul az étrendi elhízás inzulinrezisztenciájához. Cell Metab 18., 491–504 (2013).

Pang, Z. et al. A DPP4 elleni terápiás vakcina javítja az egerek glükóz metabolizmusát. Proc Natl Acad Sci USA 111., E1256–1263 (2014).

Nakagami, F. et al. A vérnyomás csökkenése és a kardiovaszkuláris szövődmények regressziója az angiotenzin II vakcinával egerekben. PLoS One 8., e60493 (2013).

Shimizu, én. et al. A p53 által kiváltott zsírszövet-gyulladás kritikusan részt vesz az inzulinrezisztencia kialakulásában szívelégtelenség esetén. Cell Metab 15, 51–64 (2012).

Shimizu, I., Yoshida, Y., Suda, M. & Minamino, T. DNS-károsító válasz és anyagcsere-betegség. Cell Metab 20, 967–977 (2014).

Xu, M. et al. Az öregedő sejtek megcélzása öregkorban fokozza az adipogenezist és az anyagcsere funkciókat. Elife 4 (2015).

Zhu, Y. et al. Az öregedő sejtek Achilles-sarka: a transzkripttól a senolitikus gyógyszerekig. Öregedő sejt 14, 644–658 (2015).

Tchkonia, T., Zhu, Y., van Deursen, J., Campisi, J. & Kirkland, J. L. Celluláris öregedés és az öregedő szekréciós fenotípus: terápiás lehetőségek. J Clin Invest 123., 966–972 (2013).

Chang, J. H. et al. Az öregedő sejtek ABT263 általi megtisztítása egerekben megfiatalítja az idős vérképző őssejteket. Természetgyógyászat 22., 78– + (2016).

Baker, D. J. et al. A természetesen előforduló p16 (Ink4a) pozitív sejtek lerövidítik az egészséges élettartamot. Természet 530, 184– + (2016).

Lane, D. P. Rák. p53, a genom őre. Természet 358, 15–16 (1992).

Nakagami, H., Koriyama, H. & Morishita, R. magas vérnyomás és cukorbetegség elleni peptid vakcinák. Vakcinák (Bázel) 2, 832–840 (2014).

Köszönetnyilvánítás

Szerzői információk

Yohko Yoshida és Ippei Shimizu egyformán járultak hozzá.

Hovatartozások

Kardiovaszkuláris Biológiai és Orvostudományi Tanszék, Niigata Egyetem Orvostudományi és Fogtudományi Doktori Iskola, Niigata, Japán

Yohko Yoshida, Ippei Shimizu, Yuka Hayashi, Ryutaro Ikegami, Masayoshi Suda, Goro Katsuumi, Takayuki Wakasugi, Masaaki Nakao és Tohru Minamino

Molekuláris öregedés és sejtbiológia osztály, Niigata Egyetem Orvostudományi és Fogtudományi Doktori Iskola, Niigata, Japán

Yohko Yoshida és Ippei Shimizu

Egészségfejlesztési és Orvostudományi Tanszék, Oszakai Orvostudományi Doktori Iskola, Oszaka, Japán

Oszakai Egyetem Orvostudományi Karának Klinikai Génterápiás Osztálya, Oszaka, Japán

A PubMed Google Scholar alkalmazásban is kereshet erre a szerzőre

Hozzájárulások

Tohru Minamino professzor a garancia erre a munkára, és teljes hozzáféréssel rendelkezett a vizsgálat összes adatához, és felelősséget vállal az adatok integritásáért és az adatelemzés pontosságáért. Y.Y. és I.S. írta a kéziratot és kutatott adatokat. Y.H., R.I., M.S., G.K., T.W., M.N., H.N. és R.M. kutatott adatok T.M. áttekintette/szerkesztette a kéziratot és felügyelte az egész projektet.

Levelezési cím

Etikai nyilatkozatok

Versenyző érdekek

A szerzők kijelentik, hogy nincsenek versengő érdekeik.

További információ

A kiadó megjegyzése: A Springer Nature semleges marad a közzétett térképeken és az intézményi kapcsolatokban szereplő joghatósági igények tekintetében.