A lépből származó interleukin-10 csökkenti a magas zsírtartalmú étrend okozta alkoholmentes zsíros hasnyálmirigy-betegség súlyosságát

Oita Egyetem, Orvostudományi Kar 1. belügyi osztálya, Yufu City, Oita, Japán

Oita Egyetem Orvostudományi Kar 1. belgyógyászati osztály, Yufu City, Oita, Japán

Hovatartozás Belgyógyászati Osztály, Orvostudományi Kar, Oita Egyetem, Yufu City, Oita, Japán

Oita Egyetem, Orvostudományi Kar 1. belügyi osztálya, Yufu City, Oita, Japán

Hovatartozás Belgyógyászati Osztály, Orvostudományi Kar, Oita Egyetem, Yufu City, Oita, Japán

Oita Egyetem, Orvostudományi Kar 1. belügyi osztálya, Yufu City, Oita, Japán

Hovatartozás Belgyógyászati Osztály, Orvostudományi Kar, Oita Egyetem, Yufu City, Oita, Japán

Koro Gotoh,
Megumi Inoue,
Kentaro Shiraishi,
Takayuki Masaki,
Seiichi Chiba,
Kimihiko Mitsutomi,
Takanobu Shimasaki,
Hisae Ando,
Kansuke Fujiwara,
Isao Katsuragi

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Gotoh K, Inoue M, Shiraishi K, Masaki T, Chiba S, Mitsutomi K és mtsai. (2012) A lépből származó Interleukin-10 lefelé szabályozza a magas zsírtartalmú étrend okozta alkoholmentes zsíros hasnyálmirigy-betegség súlyosságát. PLoS ONE 7 (12): e53154. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0053154

Szerkesztő: Juan Sastre, Valencia Egyetem, Spanyolország

Fogadott: 2012. június 13 .; Elfogadott: 2012. november 26 .; Közzétett: 2012. december 28

Finanszírozás: Ezt a munkát támogatta a Japán Egészségügyi, Munkaügyi és Jóléti Minisztérium a kezelhető betegségek mérésére irányuló kutatás támogatásával. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

A lép a test legnagyobb limfoid szerve, és fontos szerepet játszik a gazda immunfunkciójában. Egy tanulmányban az elhízott patkányok csökkent gyulladásgátló citokineket kódoló gének expresszióját mutatták, például az IL-6-ot és a lépben a tumor nekrózis faktort (TNF-α) [10]. Ezzel szemben az IL-10, amelyet több sejttípus szintetizál több szervben, beleértve a lépet is, gátolja a gyulladásgátló citokinek szintézisét. Új bizonyítékok szerint az aktivált B-sejtek, amelyek a lép peremzónájában érlelődnek, nagy mennyiségű IL-10-t termelnek, és szabályozó szerepet játszanak a káros immunválaszok elnyomásában [11]. Valójában az alacsony IL-10 termelést elhízás bizonyította [12], [13].

Az irodalom bizonyítékai alapján feltételezzük, hogy az elhízás elnyomja az IL-10 szintézisét, és ezáltal krónikus gyulladást eredményez a hasnyálmirigyben. A jelen tanulmány adatai azt mutatják, hogy az elhízás csökkenti az IL-10 expresszióját a lépben, és hogy a lépből származó IL-10 véd az elhízás okozta gyulladásos válaszoktól a hasnyálmirigyben.

Kutatási tervezés és módszerek

Állatok

Hím C57Bl/6J egerek (vad típusú egerek, 22-25 g; KBT Oriental, Japán) és IL-10-hiányos egerek (IL-10KO egerek, 002251-B6.129P2-Il10 tm1Cgn/J, Sandy Morse ajándéka, A Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) az Oita Egyetem egyik helyiségében kaptak helyet 12/12 órás világos/sötét ciklus alatt, a lámpák 07: 00-tól 19: 00-ig világítottak. Az egyetemen fenntartott IL-10KO egereket alkalmaztuk a keresztezéshez. A genotipizáláshoz a következő polimeráz láncreakció (PCR) primereket használtuk: 5′-CCACACGCGTCACCTTAATA-3 ′ (mutáns előre), 5′-GTTATTGTCTTCCCGGCTGT-3 ′ (vad típusú reverz) és 5′-CTTGCACTACCAAAGCCACA-3 ′ ( ). Valamennyi tanulmány az Oita Egyetem irányelveinek megfelelően készült, az Egyesült Államok Nemzeti Egészségügyi Intézete által kiadott, a laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó útmutató alapján. Ezenkívül ezt a tanulmányt az Oita Egyetem Kutatásfejlesztési Projekt Laboratóriumi Állattudományi Osztályának etikai bizottsága kifejezetten jóváhagyta.

Műtéti eljárás

Az egereket intraperitoneális (i.p.) nátrium-pentobarbitál (100 mg/kg) injekcióval altattuk. A splenectomia (SPX) elvégzéséhez a hasüreget kinyitották, a vér áramlásának két fő forrását (lépartéria és gyomorartéria) a léphez közeli varratokkal lekötötték és ligálták, majd a lépet gondosan eltávolították [14]. Az SPX-et 15 perc alatt végeztük. Az álművelethez a hasat kinyitották, de a lépet nem távolították el. Az összes műtéti eljárás során a hasat egy rétegben lezártuk, és 200 µl normál sóoldatot adtunk szubkután. Az eljárás eredményeként egyetlen egér sem halt meg.

Kísérleti protokoll

1. kísérlet.

A vad típusú egereket a két csoport egyikébe soroltuk (n = 6 mindegyik csoportban) az alábbiak szerint: az 1. csoportba tartozó egereket standard chow-val etettük (standard: 10% zsír, 70% szénhidrát, 20% fehérje; Diet Research, New Brunswick, NJ) 8 hétig, majd színlelt műveletnek vetették alá; A 2. csoportba tartozó egereket magas zsírtartalmú étrendben (HF: 60% zsír, 20% szénhidrát, 20% fehérje; Diet Research) etették 8 héten keresztül, majd átesett a színlelt műtéten.

2. kísérlet.

A vad típusú egereket a két csoport egyikébe soroltuk (n = 6 mindegyik csoportban) az alábbiak szerint: az 1. csoportba tartozó egereket standard héten etettük 8 hétig, majd az álműveletnek vetettük alá; A 2. csoportba tartozó egereket standard héten etettük 8 hétig, majd SPX-nek vetettük alá őket.

3. kísérlet.

A vad típusú egereket az öt csoport egyikébe soroltuk (n = 6 mindegyik csoportban) az alábbiak szerint: az 1. csoportba tartozó egereket standard színű etetéssel láttuk el 8 hétig a színlelt művelet után, és egér szérum albumint (m-albumin) adtunk be; a 2. csoportba tartozó egereket az álműtét után 8 hétig HF-vel etették, majd m-albumint adtak nekik; a 3. csoportba tartozó egereket 8 hétig HF-vel etettük SPX után, majd m-albumint adtunk hozzájuk; a 4. csoportba tartozó egereket HF-vel etettük 8 hétig SPX után, majd rekombináns egér IL-10-et kaptunk (r-IL-10, 0,5 ng/nap; Wako Chemicals, Osaka, Japán); az 5. csoport (páros táplálású csoport) egereit az álműtét után 8 hétig etették az SPX-kezelt csoport elfogyasztott táplálékával, majd m-albumint kaptak.

4. kísérlet.

A vad típusú és az IL-10KO egereket a három csoport egyikébe soroltuk (n = 6 az egyes csoportokban) az alábbiak szerint: az 1. csoportba tartozó egereket az álműtét után 8 hétig HF-vel etettük és m-albumint adtunk be; a 2. csoportba tartozó egereket HF-vel etettük 8 hétig SPX után, és m-albumint adtunk be; és a 3. csoportba tartozó egereket HF-vel etettük 8 hétig SPX után, és r-IL-10-t adtunk be (0,5 ng/nap; Wako Chemicals).

M-albumint vagy r-IL-10-et tartalmazó ozmotikus szivattyúkat (Durect Corp., Cupertino, Kalifornia, USA) 4 hétig implantáltunk az összes egér hátába, a gerincvel párhuzamosan. A rekombináns egér IL-10 dózisát úgy határoztuk meg, hogy az IL-10 átlagos normál szérumkoncentrációját (24 pg/ml) megszoroztuk egy 40 g-os egér átlagos teljes vérmennyiségével. A 24 órán át tartó táplálékfelvételt a maradék étel mérésével számoltuk ki, és a testtömeget napi 17–00 és 18–00 között határoztuk meg. A táplálékfelvételt a testsúlynak megfelelően normalizálták. Az összes egeret további 4 hétig tartottuk a beavatkozások befejezése után. Valamennyi egeret nátrium-pentobarbitállal altattuk, és a transzkardiális perfúziót követően 100 ml sóoldattal, amely 200 egység heparint tartalmaz, exsanguáltuk. A lépet és a hasnyálmirigyet eltávolítottuk és megtisztítottuk a hashártya zsírjának és nyirokcsomóinak eltávolítására.

Citokinszint a lépben, a hasnyálmirigyben és a szérumban

Kereskedelemben kapható enzimhez kapcsolt immunszorbens assay (ELISA) készleteket (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) használtunk az IL-1β, a monocita kemotaktikus protein-1 (MCP-1) és az IL-10 szintjének mérésére a lépben, a hasnyálmirigyben, és a szérum. Az egyes szervek fehérje koncentrációját Lowry módszerrel határoztuk meg. Kiszámítottuk az IL-10/IL-1β arányokat is.

Szövettani és immunhisztokémiai elemzések

A hasnyálmirigy-mintákat 4% -os pufferolt paraformaldehidben rögzítettük, paraffinba ágyazva, metszettük, xara-nában deparaffinizáltuk és Mayer hematoxilinnal és eozinnal (H&E) (Wako Chemicals), Mallory-Azan reagenssel festettük a fibrózist, és olaj-Red-O festéssel értékelje a zsír eloszlását.

Hasnyálmirigy-fibrózis

A hasnyálmirigy metszeteket Mallory-Azan festésnek vetették alá. Állatonként 20 szigetecskében a kék színként azonosított átlagos fibrotikus területet a mező százalékában értékeltük a Mac Scope 6.02 verzióval. A hidroxiprolint, a hasnyálmirigy teljes kollagéntartalmának markerét, hidroxi-prolin ELISA készlettel mértük (USCN Life Science, Inc., Houston, TX, USA).

Hasnyálmirigy triglicerid (TG) tartalma, éhomi vércukor és szérum inzulin, TG, szabad zsírsav (FFA), összes koleszterin (TC) és leptin szint

Egy éjszakán át tartó böjt után a vércukor-koncentrációt glükóz-oxidáz módszerrel és glükózanalizátorral (MS-GR101; Terumo, Tokió, Japán) mértük. A szérum inzulin és leptin koncentrációkat inzulin és leptin ELISA készletekkel határoztuk meg (Shibayagi, Gunma, Japán). A hasnyálmirigy-minták TG-tartalmát, valamint a szérum TG-, FFA- és TC-koncentrációkat a kereskedelemben kapható készletekkel (Wako Chemicals) határoztuk meg.

Statisztika

Az eredményeket átlag ± SEM-ben fejeztük ki. A statisztikai tesztek magukban foglalták a 2-tailed Student's t tesztet és a 2-utas ANOVA-t, majd Scheffe-tesztet utólagos összehasonlítás céljából. Valamennyi teszt esetében a szignifikancia szintjét p 1. táblázatban állapítottuk meg. A HF-diéta hatása a pro- és gyulladáscsökkentő citokinek lép- és szérumszintjére.

Az SPX hipofágia, testsúlycsökkenés, a TG és az FFA szint emelkedése, valamint a szérum adiponektin szint csökkenését okozza.

Megvizsgáltuk, hogy a splenectomia hozzájárul-e a hasnyálmirigy gyulladásához. Először a splenectomia hatását vizsgáltuk az energia-anyagcserére. Az SPX alacsonyabb energiafogyasztást, testtömeget, az epididymális fehér zsírszövet (WAT) súlyát és érdekes módon alacsonyabb szérum adiponektinszintet eredményezett a színlelt műtétű egerekhez képest (2. táblázat). Az éhomi vércukorszintben és a szérum inzulinszintben azonban nem volt szignifikáns különbség a két csoport között. Ezen túlmenően az SPX emelte a TG és az FFA szérumszintjét is, a TC-t azonban nem, az álkezeléshez képest (2. táblázat).

Az SPX megnöveli az inzulin-pozitív területet, és felgyorsítja a fibrózist és a lipidek felhalmozódását

Értékelték az SPX hatásait az inzulinnal festett területre, az intra-szigeten és az intra-lobularis fibrózisra, valamint a hasnyálmirigy zsírfelhalmozódására. Az SPX növelte az inzulinnal festett területet, és megbontotta a szigetek felépítését és a szigetek határait az álkezeléshez képest (1A. És 1B. Ábra). Az SPX súlyosbította a szigeten belüli (1A és 1C ábra) és az intra-lobularis fibrózist (1A és 1D ábra), a megnövekedett hidroxi-prolintartalmat (1E ábra) és az α-SMA-pozitív sejtek százalékos arányát (1A és 1F ábra), megemelte a TG-t tartalom és a zsír felhalmozódása a hasnyálmirigyben (1A. és 1G. ábra), és megnövelte a szérum leptinszintjét (1H. ábra) az álkezeléshez képest. A H&E és az olajvörös O festés eredményei azt mutatták, hogy az SPX fokozta a zsírlerakódást főleg az intra-lobularis területeken, az intra-acinar sejtek területén azonban nem, míg az acinarsejteken belüli kis vakuolok pozitívak voltak az olaj-vörös O-festésre (1A ábra).

(A) Reprezentatív képek az inzulinfestésről (balra), a Mallory-Azan festésről (középen) és a H&E festésről (jobbra) a hasnyálmirigy szakaszokról az egyes csoportok egereitől. (B − E) Inzulinfestési terület (B), intra-sziget fibrózis területe (C), intra-lobularis fibrózis területe (D), hidroxiprolin-tartalom (E), α-SMA-pozitív sejtek (F), TG-tartalom (G) a hasnyálmirigyben és a szérum leptin szintjében (H) mindegyik csoportban (n = 6). * P 2. ábra. Az SPX hatása az M1 és M2 makrofágok behatolására és a hasnyálmirigy gyulladásos válaszaira.

(A és B) A CD11c festés (balra) és a CD206 festés (jobbra) reprezentatív képei az interszigeten belüli területeken (A) és intra-lobularis területek (B) hasnyálmirigy szakaszokban minden csoportból. (C – E) A CD11c-pozitív terület százalékos aránya (C) és CD206-pozitív terület (D) és az M1/M2 arány (E) a szigeten belüli területeken. (F – H) A CD11c-pozitív terület százalékos aránya (F) és CD206-pozitív terület (G) és az M1/M2 arány (H) intra-lobularis területeken. (J és K) A pro- és gyulladáscsökkentő citokinek tartalma (J) és az interleukin (IL) -10/IL-1β arány (K) az egyes csoportok hasnyálmirigyében (n = 6). * P 3. ábra. Az IL-10 szisztémás beadása csökkenti az SPX által kiváltott változásokat a hasnyálmirigy-szigeteken.

(A) Reprezentatív képek az inzulinfestésről (balra) és a Mallory-Azan festésről (jobbra) az egyes csoportok hasnyálmirigy-szakaszain. Méretarány = 100 µm. (B − F) Inzulinfestő terület (B), szigeten belül (C) és intra-lobularis (D) fibrózis területe, hidroxiprolin tartalma (E) és α-SMA-pozitív sejtek (F) az egyes csoportok hasnyálmirigyében (n = 6). * P # P 4. ábra: Az IL-10 szisztémás beadása csökkenti az SPX-indukálta zsír felhalmozódást, a makrofágok beszivárgását és a gyulladáscsökkentő reakciókat a szigeteken.

(A) A CD11c-festés (felső szakaszok) és a CD206-festés (alsó szakaszok) reprezentatív képei az egyes szigetek hasnyálmirigy-szakaszainak szigeten belüli területein. Méretarány = 100 µm. (B − D) CD11c-pozitív területek (B), CD206-pozitív területek (C) és az M1/M2 arányok (D) az egyes csoportok szigeteiben (n = 6). * P # P # P # P $ P 5. ábra. Az IL-10 szisztémás beadása csökkenti az SPX-indukálta zsír felhalmozódást, a makrofágok beszivárgását és a hasnyálmirigy gyulladáscsökkentő reakcióit.

(A) A H&E festés, az olajvörös O festés, a CD11c festés és a CD206 festés reprezentatív képei az intra-lobularis területeken az egyes csoportok hasnyálmirigy-szakaszaiban. Méretarány = 100 µm. (B − E) TG-tartalom (B), M1/M2 arányok (C), a pro- és gyulladáscsökkentő citokinek tartalma (D) és az IL-10/IL-1β arányok (E) az egyes csoportok hasnyálmirigyében (n = 6). * P # P 6. ábra. Az SPX kevéssé befolyásolja a hasnyálmirigy-szigetek változását IL-10-hiányos egerekben.

(A) Az inzulinfestés (balra), a Mallory-Azan festés (középen) és az α-SMA festés (jobbra) reprezentatív képei a hasnyálmirigy-szakaszokban minden csoportból. Méretarány = 100 µm. (B − F) Inzulint festő terület a hasnyálmirigyben (B), intra-sziget fibrózis területe (C) és az intra-lobularis fibrózis területe (D), hidroxiprolin-tartalom (E) és α-SMA-pozitív sejtek (F) mindegyik csoportban (n = 6). * P # P 7. ábra. Az SPX csekély hatást gyakorol a hasnyálmirigy zsírfelhalmozódására IL-10-hiányos egerekben.

(A és B) Reprezentatív H&E festés (A) és olajvörös O-festés (B) az intra-lobularis területeken az egyes csoportok hasnyálmirigy-szakaszaiban. Méretarány = 150 µm. (C és D) Hasnyálmirigy-TG-tartalom (C) és a szérum leptinszint (D) mindegyik csoportban (n = 6). * P # P 8. ábra. Az SPX kevéssé befolyásolja a makrofágok beszivárgását az IL-10-hiányos egerek szigeteiben.

(A és B) A CD11c festés reprezentatív képei (A) és CD206 festés (B) az egyes csoportok hasnyálmirigy-szakaszainak szigeten belüli területein. Méretarány = 100 µm. (C – E) CD11c-pozitív területek (C), CD206-pozitív területek (D) és az M1/M2 arányok (E) az egyes csoportok szigeteiben (n = 6). * P # P 9. ábra. Az SPX kevéssé befolyásolja a makrofágok beszivárgását az IL-10-hiányos egerek intra-lobularis területén.

(A és B) A CD11c festés reprezentatív képei (A) és CD206 festés (B) az intra-lobularis területeken az egyes csoportok hasnyálmirigy-szakaszaiban. Méretarány = 100 µm. (C – E) CD11c-pozitív területek (C), CD206-pozitív területek (D) és az M1/M2 arányok (E) az egyes csoportok intra-lobularis területein (n = 6). * P # P 10. ábra. Az SPX kevés hatással van az IL-10-hiányos egerek hasnyálmirigyének gyulladásgátló citokinjeire.