A GPR105 abláció megakadályozza a gyulladást és javítja az inzulinérzékenységet egerekben, akik étrend okozta elhízással rendelkeznek

Ebben a cikkben van egy javítás. Lásd:

Absztrakt

Bevezetés

Az inzulinrezisztencia az elhízás egyik fő metabolikus jellemzője, és kulcsfontosságú tényező a 2-es típusú cukorbetegség patogenezisében. Számos bizonyíték azt mutatja, hogy a proinflammatorikus utak aktiválása az inzulin célszöveteiben ronthatja az inzulin jelátvitelt, és a krónikus, alacsony szintű szöveti gyulladás ma már a szisztémás inzulinrezisztencia egyik fontos oka (1). Számos tanulmány kimutatta, hogy a makrofágok, amelyek a kórokozókkal szembeni veleszületett immunvédelem kulcsfontosságú elemei, kritikus effektor sejtek ebben a gyulladásos folyamatban.

A nem gyulladt szövetekben jelenlévő makrofágok (rezidens makrofágok) segítenek fenntartani a homeosztázist és részt vesznek a szövetek átalakításában (2). Elhízott állapotokban azonban a makrofágok felhalmozódnak a zsír-, a máj- és az izomszövetekben, és olyan proinflammatorikus citokineket szekretálnak, mint a TNF-α és az IL-6, amelyek a JNK vagy IκB kináz β aktiválásával indukálják a sejtes inzulinrezisztenciát az inzulin receptor szerin foszforilációjával szubsztrát fehérjék. A magas zsírtartalmú étrend (HFD) expozíció után újonnan felvett makrofágok kimutatták, hogy különböznek a zsírszövet rezidens makrofágjaitól, fokozott gyulladásgátló tulajdonságokat mutatva (3). Habár a veleszületett és az adaptív immunrendszer is szerepet játszik a makrofágok aktiválásában és az elhízás toborzásában (4), az új makrofágok inzulin célszövetekbe történő toborzását szabályozó pontos mechanizmusok nem világosak.

A G-fehérjéhez kapcsolt receptorok (GPCR) különféle fiziológiai funkciókat közvetítenek, amelyek ezeket a fehérjéket metabolikus betegség terápiás célpontjává teszik. Ugyancsak az összes modern gyógyszernek körülbelül a fele a célpontja (5). A GPR105 (más néven P2Y14 receptor) egy GPCR alcsoport tagja, amelyet pirimidin-UDP-cukrok, különösen az uridin-5-difoszfoglükóz (UDP-Glc) hatásosan aktiválnak (6). A GPR105 széles körben expresszálódik számos emberi szövetben, beleértve a placentát, a zsírszövetet, a gyomrot, a belet és a különálló agyi régiókat (6). Különösen a GPR105 expresszálódik az immunsejtekben, beleértve a makrofágokat, a limfocitákat és a neutrofileket is (7–9). Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a GPR105 szabályozza a leukocita kemotaxist az UDP-Glc hatására (10, 11).

Mivel a GPR105 részt vesz a veleszületett immunválaszban, feltételeztük, hogy a GPR105 hozzájárulhat az elhízás által kiváltott inzulinrezisztencia kialakulásához. Ebben a tanulmányban értékeltük a GPR105 (hivatalos génnév: P2ry14) teljes test- és csontvelő-specifikus deléciójának hatásait az inzulinhatásra és a glükóz homeosztázisra. Megmutattuk, hogy az immunsejtekben lévő GPR105 a máj makrofág-toborzását közvetíti krónikus HFD táplálkozásban, ezt követő helyi gyulladással és inzulinrezisztenciával. Így a GPR105 új kapcsolatot teremthet a veleszületett immunitás és az inzulinrezisztencia között.

Anyagok és metódusok

Állatok

Anyagcsere vizsgálatok

Triglicerid és glikogén mérése

A triglicerid (TG) tartalmat 5% Triton X-100 tartalmú PBS-ben lévő máj homogenizátumokban és plazma mintákban (EnzyChrom, BioAssay Systems, Hayward, CA) mértük. A glikogénszinteket Seifter és munkatársai módszerével mértük. (15).

Szövettan

A máj és a zsírszövet metszetén végzett H&E festést a Kaliforniai Egyetem, a San Diego-i szövettani mag, a Moore Rákközpontban végezte. Anti-Mac2 (Cedarlane Labs) és anti-F4/80 (Abcam, Cambridge, MA) Abs-eket használtunk az immunhisztokémia során.

Immunblot elemzés

Az inzulinnal stimulált foszfo-Akt elemzéshez az egereket 7 órán át éheztettük, majd altatásban 0,2 U/kg inzulint injektáltunk az alsó vena cava-on keresztül. A szöveteket az injekció beadása előtt vagy után (3 perc májat és 10 perc epididymális fehér zsírszövetet (eWAT) és vázizomot) vettük fel, fagyasztva rögzítettük, és a standard technikáknak megfelelően elvégzett Western blot elemzéseknek vetettük alá őket. A p-Akt (Ser 473), Akt és a-tubulin elleni abs-t a Cell Signaling Technologies (Beverly, MA) cégtől szereztük be. Az Akt foszforiláció mérésére azonos mennyiségű szöveti fehérjét tartalmazó szolubilizált kivonatokat nyúl poliklonális Abs-vel aktiváltunk Akt vagy foszfo-Ser 473 Akt (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) ellen, majd második Ab detektálást végeztünk. A kvantifikáláshoz a fehérje sávok relatív intenzitását ImageJ-vel mértük, és tetszőleges egységekben fejeztük ki.

RNS izolálás és kvantitatív RT-PCR

A teljes RNS-t izoláltuk a sejtekből és szövetekből TRIzol Reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) alkalmazásával, a gyártó utasításainak megfelelően. Az első szálú cDNS-t szintetizáltuk nagy kapacitású cDNS reverz transzkripciós készlet alkalmazásával (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia). A mintákat 20 μl-es reakciókban futtattuk MJ Research PTC-200 96 lyukú termociklerrel, Chromo 4 négyszínű valós idejű rendszerrel (GMI, Ramsey, MN) összekapcsolva. A génexpressziós szinteket a szokásos háztartási gén RNS-polimeráz II-re (RPII) történő normalizálást követően, a korábban leírt ΔΔCT módszer alkalmazásával számítottuk (16). Az alapozó szekvenciák az I. kiegészítő táblázatban találhatók.

Monocita követés

A WT vagy GPR105 KO egerek retro-orbitális sinusából gyűjtött vért RBC lízisnek vetették alá, és a monocita részhalmazokat az EasySep egér monociták dúsító készletével dúsítottuk (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Kanada). Az egyes genotípusok 10-15 egéréből izolált monocitákat egyesítettünk. Ezeket a monocitákat (5x10 5-10 10x105) szérummentes RPMI-ben mossuk és 2 ml C hígító oldatban szuszpendáljuk. PKH26 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 2 × 10-3 M C hígítóval adtuk, és a sejteket 10 percig szobahőmérsékleten, sötétben inkubáltuk. A festési reakciót azonos térfogatú, 10% FBS-sel kiegészített tápközeg hozzáadásával leállítottuk. Az elegyet centrifugáljuk, és a sejteket egyszer mossuk, és szérumtartalmú táptalajban szuszpendáljuk. A PKH26 jelzés után a monocitákat megszámoltuk, és ~ 1 × 105 életképes sejtet szuszpendáltunk 0,2 ml PBS-ben, és HFD-t kapó WT egerek combvénájába injektáltuk. Öt nappal az injekció beadása után a zsírszövet makrofágokat (ATM) és a máj nonparenchymás sejteket izolálták és FACS analízissel elemezték.

A zsírsztrómás vaszkuláris frakció és a máj makrofágjainak FACS-elemzése

Az epididymális zsírpárnákat lemértük, PBS-ben leöblítettük, majd FACS pufferben (PBS/1% BSA) daráltuk. A zsírsejteket és a stromális vaszkuláris sejteket kollagenázzal emésztett zsírszövetekből állítottuk elő (17). A máj makrofág sejtjeit kétlépcsős májkollagenáz emésztéssel és frakcionálással állítottuk elő sűrűségi gradiensen (18). A stromális vaszkuláris sejtek FACS-analíziseit a makrofág-tartalom és altípusok tekintetében a korábban leírtak szerint végeztük (17). A felületi festéshez használt abszorbensek az F4/80 (BM8), a CD11b (M1/70) és a CD11c (N418; eBioscience, San Diego, CA) voltak.

Csontvelő eredetű makrofág tenyészet és in vitro kemotaxis vizsgálat

A csontvelőből származó makrofág (BMDM) tenyésztést a korábban leírt módon hajtottuk végre (17). Röviden, a csontvelősejteket átöblítettük a 10-12 hét hét WT és GPR105 KO egerek comb- és sípcsontjaiból. A sejteket ezután BMDM-ekké differenciáltuk RPM táptalajban, amely rM-CSF-et, alacsony endotoxin-FBS-t és sztreptomicint/penicillint tartalmazott. Öt nappal a differenciálás után a sejteket összegyűjtöttük, és DMEM-ben szuszpendáltuk 1 g/l glükózzal. Az in vitro kemotaxis vizsgálatot a korábban leírtak szerint hajtottuk végre (19). Körülbelül 105 sejtet ültettünk egy 8 μM polikarbonát szűrő (24 transz -well formátumú; Corning, Lowell, MA) felső kamrájába, és az UDP-Glc koncentrációjú DMEM-et helyeztük az alsó kamrába. 3 óra elteltével az alsó kamrába vándorolt sejteket megszámoltuk.

Az UDP-glükóz szintjének mérése a plazmában

A plazmamintákat 5% triklór-ecetsavval kivontuk, majd etil-éterrel extraháltuk és semlegesítettük. Az extraktumok UDP-Glc tartalmát a [32P] -pirofoszfát (32 PPi) + UDP-glükóz enzimatikus átalakításán alapuló esszével számítottuk [32P] UTP + glükóz-1P-vé, amint azt korábban leírtuk ( 20.) Röviden, a mintákat 1 órán át inkubáltuk 1 U/ml UDP-Glc pirofoszforiláz jelenlétében pékélesztőből (Sigma) és 100 nM 0,1 μCi 32 PPi (Perkin Elmer) jelenlétében. Az inkubációkat 0,5 mM PPi hozzáadásával és ezt követő melegítéssel (2 percig 95 ° C-on) befejeztük. Az így kapott [32P] fajokat HPLC-vel választottuk el, Nova-Pack C18 oszlopon keresztül (Waters), és online mennyiségileg meghatároztuk a Flo-One 500TR Radiomatic analizátorral (Packard). Az UDP-glükóz (Fluka) ismert mennyiségeinek felhasználásával végzett kalibrációs görbét párhuzamosan hajtottuk végre.

Statisztikai analízis

Javult a GPR105 KO HFD-vel táplált egerek glükóz homeosztázisa. (A) A WT és GPR105 KO egerek testtömeg-növekedése NC-n és HFD-n (n = 12 csoportonként). (B) WT és GPR105 KO egerek táplálékfelvétele HFD-n (n = 12). (C) Glükóz tolerancia teszt NC és HFD egereken. Glükózt (1 g/kg) injektáltunk i.p. 7 órás böjt után farokvért gyűjtöttünk a glükóz mérésére (n = 8). (D) A WT és GPR105 KO egerek éhomi inzulinszintjei NC-n és HFD-n (n = 8). (E) HFD-vel táplált WT és GPR105 KO egerekben mért akut inzulinszekréció bazális (7 óra gyors) és 15 perccel az orális glükózfertőzés után (n = 8). (F) Inzulin tolerancia teszt HFD egereken. Intraperitoneális inzulint (0,6 U/kg) injektáltunk 7 órás éheztetett HFD WT és GPR105 KO egerekbe. A vércukorszintet a megadott időpontokban mértük. Valamennyi értéket átlagként ± SEM fejezzük ki. * p Akt3, valamint az Akt és a HSP90 foszforilációja a májban, a zsírszövetben és a vázizmokban. A szöveteket az inzulininjekció előtt vagy a jelzett időpontban gyűjtöttük (0,2 E/kg) az alsó vena cava-ba.

Javult a GPR105 KO HFD-vel táplált egerek inzulinérzékenysége. HFD-vel táplált WT (n = 6) és GPR105 KO (n = 6) egerekben a hiperinzulinémiás-euglikémiás szorítóval meghatározott in vivo inzulinérzékenység. GIR (A), NDK (B), IS-NDK (C), a bazális és a szorító HGP (D) és a HGP elnyomása (E) átlagként ± SEM. * p Akt3, valamint az Akt és a HSP90 foszforilációja a májban, a zsírszövetben és a vázizmokban. A szöveteket az inzulininjekció előtt vagy a jelzett időpontban gyűjtöttük (0,2 E/kg) az alsó vena cava-ba.

A GPR105 KO egerek szintén szignifikánsan alacsonyabb HGP arányt mutattak ki mind a bazális, mind az egyensúlyi állapotban (2D. Ábra), jelezve, hogy a HFD-vel táplált GPR105 KO egerekben fokozott az inzulin HGP elnyomó képessége (2E ábra). A clamp vizsgálatokban tapasztalt javult máj- és vázizom inzulinérzékenységnek megfelelően az AKT foszforilációja szignifikánsan megnövekedett a GPR105 KO egerek máj-, zsír- és vázizomszöveteiben inzulinstimuláció után (2F ábra). Ezek az in vivo eredmények együttesen azt a következtetést támasztják alá, hogy a GPR105 KO egerek javított szisztémás inzulinérzékenységet mutatnak a HFD után, fokozott inzulinhatással a májban, a vázizomban és a zsírszövetekben.

Csökkent máj steatosis és gyulladás GPR105 KO egerekben

A máj súlya csökkent a GPR105 KO egerekben (3A. Ábra) a GPR105 KO és WT egerek hasonló testtömege ellenére. A GPR105 KO egerek szintén alacsonyabb máj-TG- és glikogéntartalmat mutattak (3B. Ábra, 3C. Ábra), valamint szövettan alapján alacsonyabb fokú májsteatózist mutattak (3D-s ábra).

Csökkent makrofág infiltráció és gyulladás a májban. Májsúly (A), TG (B) és a glikogén-tartalom (C) a májban átlag ± SEM. * p + sejt az összes nem parenchima sejt százalékában, áramlási citometriával. * p + sejtek GPR105 KO egerekből (3G. ábra), összhangban a csökkent májgyulladással. Ezenkívül számos proinflammatorikus citokin (IL-1β, IL-10, IL-6 és TNF-a) génexpressziója mélyen csökkent a májszövetekben a GPR105 KO egerekből (3H ábra). Megjegyzendő, hogy a zsírsav-szintetáz és az acetil-CoA karboxiláz szintje csökkent, míg a peroxiszomális proliferátor-aktivált receptor a, a közepes láncú acil-CoA dehidrogenáz, a peroxiszomális proliferátor által aktivált receptor γ koaktivátor-1β, a mitokondriális transzkripciós faktor A és a citokróm c 2. alegysége az oxidáz szintje megnőtt (3G ábra), ami arra utal, hogy a csökkent lipogenezis és a fokozott zsírsav oxidáció egyaránt hozzájárulhat a GPR105 KO egereknél megfigyelt javuló máj steatosishoz.

Makrofágok a zsírszövetben. (A) Az eWAT súlya a teljes testtömeg százalékában (n = 8). (B) GPR105 expresszió adipocitákban és SVF sejtekben kvantitatív PCR-rel. (C) Anti-Mac2 Ab-vel festett eWAT reprezentatív immunhisztokémiai képei. Mérlegsorok, 100 μm. (D) F4/80 + CD11b + és (E) F4/80 + CD11b + CD11c + sejtek eWAT-ban áramlási citometriával mérve (n = 6). (F) Gén expresszió az eWAT-ban. Az adatokat átlag ± SD-ként adjuk meg. * p +, az M1-szerű makrofágok kimutatták, hogy szétválasztják az inzulinérzékenységet csökkentő proinflammatorikus citokineket (17, 24). Bár a máj makrofágjainak száma csökkent, az epididymális zsírszövet immunhisztokémiai festése a Mac2 makrofág markerrel nem mutatott szignifikáns különbségeket a zsírszövet koronaszerkezeteiben (4C. Ábra). Hasonlóképpen, az áramlási citometria sem mutatott különbségeket sem az F4/80 + CD11b + (kettős pozitív; 4D. Ábra), sem az F4/80 + CD11b + CD11c + (háromszor pozitív) makrofágokban (4E. Ábra) az eWAT stromalis vascularis frakció GPR105 KO egerekből. Nem tudtunk kimutatni jelentős változásokat a proinflammatorikus génexpresszióban sem. Bár az IL-1β génexpresszió csökkent, hasonló változásokat nem figyeltek meg a TNF-α és IL-6 génexpresszióban (4F. Ábra).

A GPR105 deléció csökkenti a makrofág kemotaxist in vivo és in vitro

Mivel a GPR105 kimerülése a májban csökkent makrofágszámot eredményezett, ezt követően megvizsgáltuk, hogy ennek a jelenségnek tulajdonítható-e a csökkent makrofág-toborzás és a megnövekedett makrofág-forgalom. Ezért egy in vivo monocita nyomonkövetési kísérletet végeztünk a WT vagy GPR105 null monociták májba és zsírszövetekbe történő migrációs képességének felmérésére. Ellenőriztük, hogy a monociták a WBC populáció> 90% -át tették ki dúsítás után (1. kiegészítő ábra). A GPR105 KO vagy a WT donor egerekből izolált PKH26-jelölt monocitákat iv. a WT fogadó egereknek HFD-n. Öt nappal az injekció beadása után a nem parenchimás sejtfrakció PKH26-jelölt sejtjeit áramlási citometriával számoltuk meg. Korábban kimutattuk, hogy a makrofágok a PKH-val jelölt sejtek több mint 90% -át képviselik, mind a máj, mind a zsírszövet nem parenchimális frakciójába toborozva (25).

Amint az 5A. Ábra mutatja, kevesebb máj PKH26 + monocitát azonosítottak azokban az egerekben, amelyek GPR105 KO monocitákat kaptak (5A. Ábra). Ezzel szemben a zsírsztrómás vaszkuláris frakcióban a PKH26 + sejtek százalékos aránya nem különbözött a két csoport között (5B. Ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a GPR105 szerepet játszik a monocita reakciójában a májból származó kemoattrakt jelekre, de nem a zsírszövetből. Ezenkívül a máj PKH26 + sejtjeinek csökkenésének nagysága GPR105 KO egerekben arra utal, hogy a máj F4/80 + sejtjeinek csökkenése (3G. Ábra) valószínűleg a makrofágok toborzásában mutatkozó különbséget tükrözi a HFD-ben a rezidens szöveti makrofágok (Kupffer sejtek) helyett. táplált GPR105 KO egerek.

Javult a glükóz homeosztázis és az inzulinérzékenység a GPR105 KO csontvelővel átültetett egerekben. (A) Glükóz tolerancia teszt WT-BMT és KO-BMT egereken NC vagy HFD-n (n = 12). * p 473 az Akt és a HSP90 foszforilációja a májban, a zsírszövetben, valamint a WT-BMT és a KO-BMT vázizmaiban. A szöveteket a megadott időpontokban gyűjtöttük össze az inzulininjekció előtt és után (0,2 E/kg). * p ATM zsírszövet makrofág BMDM csontvelő eredetű makrofág BMT csontvelő transzplantáció eWAT epididymal fehér zsírszövet GDR glükóz ártalmatlanítási arány GIR glükóz infúzió sebesség GPCR G fehérjéhez kapcsolt receptor GTT glükóz tolerancia teszt HFD magas zsírtartalmú étrend HGP máj glükóz termelés IS- GDR inzulinstimulált GDR ITT inzulin tolerancia teszt KO knockout NC normál chow 32 PPi [32 P] -pirofoszfát RHM toborzott máj-makrofág TG triglicerid UDP-Glc uridin 5-difoszfoglükóz WT vad típusú.