A dermális mikrovaszkuláris reaktivitás gyulladással összefüggő adaptációi kísérik az elhízás és a 2-es típusú cukorbetegség kialakulását

Marie-Sophie Nguyen-Tu

1 LBTI, UMR CNRS 5305, 69367 Lyon Cedex 07, Franciaország

2 Lyoni Egyetem 1, 69367 Lyon Cedex 07, Franciaország

Pierre Nivoit

1 LBTI, UMR CNRS 5305, 69367 Lyon Cedex 07, Franciaország

2 Lyoni Egyetem 1, 69367 Lyon Cedex 07, Franciaország

Valérie Oréa

1 LBTI, UMR CNRS 5305, 69367 Lyon Cedex 07, Franciaország

2 Lyoni Egyetem 1, 69367 Lyon Cedex 07, Franciaország

Sandrine Lemoine

2 Lyoni Egyetem 1, 69367 Lyon Cedex 07, Franciaország

Cécile Acquaviva

1 LBTI, UMR CNRS 5305, 69367 Lyon Cedex 07, Franciaország

3 Centre de Biologie et Pathologie Est, Egyetemi Kórház, Hospices Civils de Lyon, 69677 Bron, Franciaország

Aurélie Pagnon-Minot

4 Novotec, ZAC du Chêne Europarc, 11 rue Edison, 69500 Bron, Franciaország

Bérengère Fromy

1 LBTI, UMR CNRS 5305, 69367 Lyon Cedex 07, Franciaország

2 Lyoni Egyetem 1, 69367 Lyon Cedex 07, Franciaország

Jaswinder K. Sethi

5 Orvostudományi Kar, Southamptoni Egyetem, Fejlesztéstudományi Intézet épület, Southamptoni Általános Kórház, Southampton, SO16 6YD UK

6 Országos Egészségügyi Kutató Intézet Southampton Biomedical Research Center, University Hospital Southampton NHS Foundation Trust, Southampton General Hospital, Southampton, SO16 6YD UK

7 Élettudományi Intézet, Élettudományi épület, 85 épület, Southamptoni Egyetem, Highfield, Southampton, SO17 1BJ UK

Dominique Sigaudo-Roussel

1 LBTI, UMR CNRS 5305, 69367 Lyon Cedex 07, Franciaország

2 Lyoni Egyetem 1, 69367 Lyon Cedex 07, Franciaország

Társított adatok

Absztrakt

Háttér/Célkitűzések

Az elhízás megnövekedett gyakorisága nagy előrelépéseket tett a specifikus zsírraktárak megértésében és azok részvételében a kardio-metabolikus egészségben. Az elhízás hatása a dermális fehér zsírszövetre (dWAT) és a bőr mikrovaszkuláris funkcionalitására azonban továbbra sem tisztázott. Ez a tanulmány a dWAT és a dermális mikrovaszkuláris funkcionalitás időbeli változásainak vizsgálatát tűzte ki célul a diéta okozta elhízás és a 2-es típusú cukorbetegség kialakulása során egerekben.

Mód

A hiperkalorikus étrend (HCD) által indukált elhízás és a 2-es típusú cukorbetegség egérmodelljének metabolikus fenotipizálását három időpontban végeztük, amelyek a betegség kialakulásának három különböző szakaszát tükrözték; 2 hét HCD-túlsúlyos, metabolikusan egészséges, 4 hét HCD-elhízott-prediabetikus és 12 hét HCD-elhízott 2-es típusú cukorbeteg egér. A dWAT expanzióját szövettanilag jellemeztük, és a dermális mikrovaszkuláris reaktivitás változását értékeltük a nyomásra és az SNP és Ach értágítókra reagálva.

Eredmények

A HCD a dWAT progresszív terjeszkedését és a pro-gyulladásos markerek (IL1β és COX-2) fokozott expresszióját eredményezte. A nyomás okozta (PIV) és az Ach által indukált (endothelium-függő) vazodilatáció károsodása korán, túlsúlyos, metabolikusan egészséges egereknél jelentkezett. A maradék értágító válaszok NOS-függetlenek voltak, de érzékenyek a COX gátlására. Ezek a változások az NO és az adiponektin biohasznosulásának csökkenésével jártak együtt, és exogén adiponektin vagy hiperinsulinémia mentették meg őket. Az elhízott prediabetikus egerekben továbbra is károsodott az Ach-függő értágulat, de a PIV normalizálódott. Ez a normalizálás egybeesett az emelkedett endogén adiponektin- és inzulinszinttel, és érzékeny volt a NOS, a COX és a PI3K gátlására. Elhízott 2-es típusú diabéteszes egerekben mind az Ach-stimulált, mind a nyomás által kiváltott értágító válaszok fokozódtak a fokozott COX-2-függő prosztaglandin válasz révén.

Következtetések

Bebizonyítottuk, hogy az elhízás, az anyagcsere-diszfunkció és a 2-es típusú cukorbetegség kialakulása a HCD-vel táplált egerekben fokozott dermális adipozitással és a kapcsolódó metaflammatikával jár együtt a dWAT-ban. Fontos, hogy ezek az időbeli változások a betegség stádium-specifikus dermális mikrovaszkuláris reaktivitásához is kapcsolódnak, amelyek tükrözhetik a metaflammáció által vezérelt adaptív mechanizmusokat.

Bevezetés

Ebben a tanulmányban az elhízás és a 2-es típusú cukorbetegség kialakulása során megvizsgáljuk a dermális adipozitás, a dermális mikrovaszkuláris funkcionalitás és az endoteliális funkció időbeli változását. Feltételezzük, hogy a dermális zsírréteg átalakítása és a 2-es típusú cukorbetegség kialakulása összefüggésben áll a dermális mikrovaszkuláris nyomásreaktivitás változásával. Eredményeink arra utalnak, hogy kezdetben, a fokozott zsírbetegség megjelenésekor, a neurovaszkuláris és az endotheliális funkció változásai összefüggenek a megváltozott adipokintermeléssel. Ahogy azonban az elhízás pre-diabéteszes és diabéteszes állapotba kerül, további adaptációk lépnek fel, hogy normalizálják, majd fokozzák a dermális vaszkuláris reaktivitását a nyomásra. Mechanikusan ezek az adaptív változások magukban foglalják a kulcsfontosságú értágító jelátviteli utak elmozdulását egy NO-függőtől a pro-gyulladásos COX-2/PG által vezérelt programok felé.

Kutatási tervezés és módszerek

Állatok

Glükóz és inzulin tolerancia tesztek

2, 4 és 12 hetes étrend után glükóz- és inzulin-tolerancia teszteket hajtottak végre 5 óra éhgyomri egereken, miután intraperitoneális (ip) injekciót kaptak glükóz (1 g/kg testtömeg 1 g) glükóztolerancia teszt vagy inzulin ( 0,75 U kg -1 testtömeg; Lilly, Suresnes, Franciaország) inzulin tolerancia teszthez. A vércukorszintet 2 órán át glükométerrel (AccuCheck® Active; Roche, Lyon, Franciaország) ellenőriztük. Azokat az egereket, amelyeknél a kiindulási éhgyomri vércukorszint> 250 mg/dL volt, diabéteszesnek tekintették, míg a 200 és 250 mg/dL közötti szinteket prediabetikusnak és −1-nek határozták meg; Nesdonal, Merial, Lyon, Franciaország) és a fekvő helyzetben lévő egereket inkubátorban pihentettük, kontrollált bőrhőmérséklet és szisztolés artériás vérnyomás mellett, a korábban leírtak szerint [28]. Az állat bármely bőrelváltozása a kísérlet napján kirekesztéshez vezetett.

Endothelium-függő és független értágulat

Lézeres Doppler-fluxust (LDF) acetilkolin (Ach) és nátrium-nitropruszid (SNP) (Saint Quentin Fallavier, Franciaország) iontoforézis hatására mértünk a bőr mikrovaszkuláris reaktivitásának értékelésére az állatok szőrtelen hátán, a korábban leírtak szerint [19, 28].

Nyomás okozta értágulat

A helyi nyomás által kiváltott LDF-választ a korábban leírt módon mértük [19, 28]. A nyomásmérőt a fej tetejének szőrtelen bőrére helyeztük, és a külső nyomást fokozatosan növeltük 2,2 Pa s −1 nyomáson a lézeres Doppler szondán keresztül fecskendőpumpa segítségével.

Farmakológiai gátlási vizsgálatok

A stimulált vazodilatációt DMSO-val (kontroll), wortmanninnal végzett előkezelés után értékeltük a foszfatidil-inozitol-3-kináz (PI3K) vagy az N-nitro-L-arginin (LNNA), egy NO-szintáz (NOS) inhibitor gátlására. Szisztolés artériás vérnyomást mértünk, hogy ellenőrizzük az LNNA, egy specifikus NOS-gátló (20 mg kg-1; ip) által okozott vérnyomás-növekedést [28]. A wortmannin injekcióhoz (4% DMSO-ban; 16 µg kg -1; ip) a protokollt a fent leírtak szerint hajtottuk végre, 15 perces pihenőidő után [29]. Indometacint (5 mg kg -1; ip) alkalmaztunk a ciklooxigenázok (COX) nem specifikus inhibitoraként [30, 31], míg az indukálható COX-2 (Cayman Chemicals, MI, USA) specifikus gátlását SC- 58125 (10 mg kg -1; iv.) [32]. Az inzulin és az adiponektin PIV-ben betöltött szerepét egy egyszeri inzulin injekcióval (0,05 UI 25 -1 g egér testtömeg; Lilly, Suresnes, Franciaország) vagy adiponektin egyetlen intradermális injekciójával (50 µg.mL -1) értékeltük.; Enzo LifeSciences, Farmingdale, NY). A PIV értékelését 15 perccel az inzulininjekció után és közvetlenül az adiponektin injekció után végeztük.

Az érrendszeri kísérletek végén az állatokat tiopental túladagolásával eutanizálták.

Plazma biokémia

A plazmát szívszúrással nyertük, és a Center de Biologie Est (Lyon, Franciaország) elemezte lipidekre (koleszterin/triglicerid, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL; szabad zsírsav, Wako Chemicals, Osaka, Japán), kereskedelmi színtani ELISA-val. teszteket alkalmaztunk a plazma inzulin (Mercodia, Uppsala, Svédország) és az adipokinek (leptin/adiponectin, Millipore, St. Charles, MO) meghatározásához a gyártó protokollja szerint.

Western blottolás

Anti-COX-2 alkalmazásával (Cayman Chemicals, 160126) immunblotot végeztünk az egyes csoportokból betakarított bőrön. A farmakológiai gyógyszerek hatékonyságát immunfolt segítségével ellenőriztük anti-foszfo-eNOS-Ser 1177, anti-foszfo-Akt-Ser 473 (Cell signaling Technology; Danvers, MA) alkalmazásával a kezelt bőrön, amelyet a PIV maximális értékével gyűjtöttünk be.

Immunhisztokémia és morfometriai elemzés

Statisztikai analízis

A HCD hatása az elhízás és a metabolikus szindróma kialakulására. Az egereket hiperkalórikus étrenddel (töltött körök és rudak) vagy standard chow-val (nyitott körök és rudak) etették 2, 4 vagy 12 hétig. a Az egerek testtömege a 12 hetes etetési program során. b A kontroll és a HCD-vel táplált egerek kalóriabevitele. c A szubkután fehér zsírszövet (ScWAT) súlya. d Az epididymális fehér zsírszövet (EpiWAT) súlya. e Keringő leptinszintek. f A keringő adiponektin (AdipoQ) szintek. g A glükózszint görbe alatti területe (AUC) a glükóz tolerancia tesztek (IP-GTT) és h Inzulin tolerancia tesztek (IP-ITT). Lásd még az 1. ábrát. Az adatok az átlag ± SEM értékét mutatják (n = 10 minden csoportban vagy n = 50 az egyes csoportokban a testtömegre vonatkoztatva). * P † p †† p ††† p (1f ábra) 1f) alacsonyabb, de az egerek továbbra is euglikémiásak voltak, és nem figyeltek meg különbségeket a plazma inzulinszintjeiben (S1. táblázat), a glükóz toleranciájában (1. ábra. 1g ábra és S1A. ábra) vagy az inzulin toleranciájában (1. ábra. 1h ábra és 1. ábra). Ezért ez a 2-HCD csoport a "túlsúlyos, metabolikusan egészséges" egerek modelljét képviselte, bár csökkentett adiponektin tartalommal. 4 hét múlva a 4-HCD egerek elhízottak és normalizált adiponektinszinttel rendelkeznek (1. ábra ) 1f) és nagyon enyhén hiperinzulinémiás és hiperglikémiásak (S1. Táblázat). Mind a glükóz- (ábra (1.g ábra, 1g és S1C. Ábra), mind az inzulin- (ábra: 1.h, 1h és S1D ábra) tolerancia az életkornak megfelelő kontroll étrendet tápláló egerekhez képest is enyhén károsodott. Ezért ez a 4-HCD csoport az „elhízott-prediabetikus” egerek modelljét képviselte. Végül a 12-HCD egerek mutatták ki a legnagyobb mértékű elhízást, hiperglikémiát, hiperinsulinémiát hyperlipidaemia (S1. táblázat), csökkent glükóz- és inzulin-tolerancia mellett. (1g, h és S1E-F ábra). Ezért ezek az egerek az „elhízás és a 2-es típusú cukorbetegség”.

Figyelemre méltó, hogy a sovány egerekkel táplált kontroll étrend anyagcsere-profiljában időfüggő változásokat is mutatott, amelyek 12 hét után jelentősek lettek. A változások kicsi, de jelentős testtömeg-növekedést (1a. Ábra, S1. Táblázat) és táplálékfelvételt (1. ábra (1b. Ábra, 1b. Ábra) tartalmaztak), de nem jelentettek jelentősen nagyobb WAT-raktárakat (1c., D. Ábra). sem megnövekedett plazma leptin (ábra (1.e ábra). 1e). A legöregebb sovány egerek toleránsak maradtak mind a glükóz (1. ábra (1g. Ábra) 1g), mind az inzulin (1. ábra (1.h) ábra. 1 óra) szempontjából. Ugyanakkor a plazma adiponektin szintje fokozatosan csökkent (ábra (1f ábra) 1f), és enyhe éhomi hiperglikémiát figyeltek meg 12 hétig (S1. Táblázat).

A dWAT átalakítása kíséri a HCD által kiváltott elhízás kialakulását

A HCD-vel táplált egerekben a dermális zsírréteg [33] már a legkorábbi időpontban kitágult (2a., B. Ábra). A dWAT idővel nagyobb területet foglalt el a HCD-n (2a., B. És S2A. Ábra), és mind az adipocita hiperplázia, mind a hipertrófia progresszív növekedése kísérte a kontroll étrenddel etetett egerekhez képest (2.a ábra, 2a. A makrofágok (anti-F4/80) és a gyulladásgátló citokinek (anti-IL-1β) immunhisztokémiai festése 4 hét elteltével a makrofágok infiltrációjának fokozatos növekedését mutatta (2.a ábra. 2a.). 12-HCD egereknél a pro-gyulladásos (M1-szerű) makrofágok észrevehető csoportosulása következett be a „korona-szerű” struktúrákban. (Ábra (2c 2c ábra és S2C ábra). HCD és kontroll egereknél azonban nem történt változás a dermális erek felépítésében (ábra (2a 2a ábra).

A HCD hatása a bőr zsírszövetének átalakítására és gyulladására. a A jelzett csoportok immunhisztokémiai metszeteinek reprezentatív fotográfiái a hematoxilinnel és eozinnal, F4/80-mal vagy anti-IL1-béta-val történő festést követően. (Méretarányok: 500 µm (alacsony mag) és 25 µm (nagy mag).) b A dermális zsírszövet vastagságát a kombinált papilláris dermis és a retikuláris dermis vastagságához viszonyítva határoztuk meg. Öt egér mindegyikéhez 10 véletlenszerűen kiválasztott mérést számoltunk ki szövettani képek alapján, és a J. kép felhasználásával mértük. Az adatok az átlag ± SEM értéket képviselik (n = 5 mindegyik csoportban) * p (3a. Ábra). (3a) Ez a PIV-válasz azonban normalizálódott a 4-HCD egerekben, és jelentősen megnőtt a 12-HCD egerekben az életkorhoz illeszkedő sovány kontrollokhoz képest. Ezzel szemben a maximális SNP-stimulált (endothelium-független) vazodilatáció hasonló maradt a HCD és a kontroll csoportok között (ábra (3b. Ábra) 3b) minden csoportban, ami arra utal, hogy a dermális simaizomsejtek relaxációs képessége nem változik az elhízás kialakulása során és 2-es típusú cukorbetegség. Az Ach által stimulált (endothelium-függő) értágulat azonban a korai betegség stádiumában károsodott mind a 2-HCD, mind a 4-HCD egerekben (ábra (3c. Ábra). 3c). Figyelemre méltó, hogy a 12-HCD egerek nagyobb vazodilatációs választ mutattak az Ach-re, ami részben annak tudható be, hogy csökkent a kontroll sovány egerekben az Ach-stimulált vazodilatáció (ábra (3c. Ábra, 3c)), ami hasonló ideiglenes endothel diszfunkciót mutathat ki 2-HCD egerekhez. A koleszterinszint azonban minden csoportban a normális tartományban maradt, kivéve az elhízás/2-es típusú cukorbetegséghez kapcsolódó hiperkoleszterinémia zavaró hatását a mikrovaszkuláris változásokra.

A HCD időfüggő hatása az érrendszeri reaktivitásra. A válaszként a bőr lézeres Doppler áramlásmérésének (LDF) maximális százalékos növekedését határoztuk meg a enyhe nyomás, b az SNP iontoforetikus leadása és c Ach. Az adatok az átlag ± SEM értéket képviselik (n = 10 minden csoportban); * p † p 4a, b) vagy Ach- (4c. ábra, d) stimulálta az értágulatot 2-HCD egerekben. Ez arra utal, hogy a NOS-függő értágulat elvész. A PI3K inhibitor, a wortmannin, mindkét étrendcsoportban nem volt hatással mindkét értágító tesztre (4a – d. Ábra). A foszfoaktív-AKT és a foszfoaktív-eNOS Western blottolása azonban megerősítette, hogy ezek az inhibitorok molekuláris szinten hatékonyak voltak (S4. Ábra). Ezenkívül az indometacinnal, egy COX-1/2 gátlóval végzett kezelés azt mutatta, hogy a 2-HCD egerekben a maradék vaszkuláris funkcionalitás érzékeny volt a prosztaglandin-függő jelekre (4a – d. Ábra).

A PIV normalizálása elhízott prediabetikus egerekben adaptív PI3K-függő NO-jeleket igényel

Mivel az elhízott prediabetikus (4-HCD) egerek inzulinszintje megemelkedett (S1. Táblázat)) és a normalizált adiponektinszintek (ábra (1f ábra), 1f) és a PIV válaszok hasonlóvá váltak az életkorhoz illeszkedő sovány egerekhez (ábra (3a. ábra), 3a), feltártuk annak lehetőségét, hogy a hiperinsulinemia által vezérelt inzulin szignálozás részt vett az adaptív mechanizmusban a PIV normalizálására. A funkcionális inzulinreceptor/PI3K/AKT/NOS jelátviteli út követelményének feltárása érdekében megismételtük a PIV és az Ach által stimulált teszteket, miután 4-HCD egerekben beadtuk az út szelektív inhibitorait. Itt a PIV érzékeny volt az LNNA NOS-gátlására és a PI3K-gátlóra, a wortmanninra (ábra (5b. Ábra). 5b). Ezzel szemben a kontroll egerek érzéketlenek maradtak a wortmannin iránt (ábra (5a. Ábra). 5a). Ez egy PI3K-függő NOS útvonal toborzását jelzi a 4-HCD egerek PIV válaszában, míg a PI3K független NOS útvonal működőképes maradt a kontroll sovány egerekben. Érdekes módon a wortmannin és a NOS érzékenységét nem figyelték meg az Ach-stimulált értágulatban (5c. Ábra, d) 4-HCD egerekben (ábra (5.d ábra). 5d). Az Ach reakciója azonban 4-HCD egerekben továbbra is indometacin-érzékeny (COX-függő) maradt, mint a 2-HCD esetében.