Határok a farmakológiában

Etnofarmakológia

Ez a cikk a kutatási téma része

Gyógynövények szív- és érrendszeri és neurodegeneratív öregedéssel kapcsolatos betegségek esetén: padtól az ágyig Az összes 20 cikk megtekintése

Szerkesztette

Youhua Xu

Makaói Tudományos és Műszaki Egyetem, Makaó

Felülvizsgálta

Bin Geng

Fuwai Kórház, Kínai Orvostudományi Akadémia és Peking Union Orvosi Főiskola, Kína

Yanfei Liu

Pekingi Kínai Orvostudományi Egyetem, Kína

A szerkesztő és a lektorok kapcsolatai a legfrissebbek a Loop kutatási profiljukban, és nem feltétlenül tükrözik a felülvizsgálat idején fennálló helyzetüket.

Cikk letöltése
- PDF letöltése
- ReadCube
- EPUB
- XML (NLM)
- Kiegészítő
  Anyag
Exportálás
- EndNote
- Referencia menedzser
- Egyszerű TEXT fájl
- BibTex

OSZD MEG

Eredeti kutatás CIKK

1 Guang’anmen Kórház, Kína Kínai Orvostudományi Akadémia, Peking, Kína
2 Xiyuan Kórház, Kína Kínai Orvostudományi Akadémia, Peking, Kína
3 Pekingi Kínai Orvostudományi Egyetem, Peking, Kína

Bevezetés

Az ateroszklerózis számos kardiovaszkuláris betegség (CVD) közös kóros alapja. Noha a lipidcsökkentő gyógyszereket, az intervenciós terápiát és más hagyományos kezeléseket széles körben alkalmazták az emberi egészséget fenyegető veszélyek csökkentésére, az érelmeszesedés és az azzal összefüggő CVD-k továbbra is a halálozás legfőbb oka világszerte (Anderson et al., 1991; Vilahur et al., 2014). Az érelmeszesedést diszlipidémiák kísérik, beleértve az alacsony sűrűségű lipoprotein-koleszterin (LDL-C), az összes koleszterin (TC), a triglicerid (TG) stb. Emelkedett szintjét (Ju et al., 2018). A sztatinok a diszlipidémiák első vonalbeli farmakoterápiája, és hatékonyan ellenőrzik a lipidszintet és csökkentik a fő káros kardiovaszkuláris eseményeket (MACE) (Catapano et al., 2016; Kobiyama and Ley, 2018). A sztatinokról azonban beszámoltak, hogy korrelálnak a myopathiával, vesebetegséggel, máj- és epebetegségekkel és más eseményekkel kapcsolatos különféle nemkívánatos eseményekkel (Law és Rudnicka, 2006). Ezenkívül az érelmeszesedést a nagy és közepes artériák krónikus gyulladásos betegségének tekintik (Ross, 1999; Libby, 2002; Hansson, 2005), a gyulladásgátló citokinek, például a tumor nekrózis-alfa faktor (TNF-α) változásával. ), interleukin (IL) -6 és IL-1β, és gyulladáscsökkentő citokinek, beleértve az IL-10-et (Tedgui és Mallat, 2006). Felülvizsgáltuk ezen citokinek szerepét az érelmeszesedés kialakulásában, progressziójában és szövődményeiben (Tedgui és Mallat, 2006).

Az elmúlt évtized tanulmányai kimutatták, hogy a bél mikrobiota bizonyos emberi betegségekkel társul, beleértve az elhízást (Boulange et al., 2016), a 2-es típusú cukorbetegséget (Qin et al., 2012), a hiperkoleszterinémiát (Martinez et al., 2009) és CVD-k (Tang et al., 2017), amelyek mindegyike összefügg az érelmeszesedéssel (Jonsson és Backhed, 2017). A bél mikrobiota szerepe az érelmeszesedésben az elmúlt években kezdett felértékelődni, főként a gyulladás és immunitás szabályozását, valamint a bél mikrobiota és metabolitjai által a koleszterin és lipid anyagcserét (Jonsson és Backhed, 2017; Ma és Li, 2018) . Ezek az eredmények rávilágítottak az érelmeszesedés nagy potenciális megelőző és terápiás előnyeire, amelyek a bél mikrobiomjának megcélzásával valósulhatnak meg.

A berberin (BBR) egy izokinolin-alkaloid, amelyet különféle gyógynövényekből lehet izolálni, mint pl Coptis chinensis Franch és Cortex phellodendri. A BBR különféle biológiai funkciókkal rendelkezik, beleértve a gyulladáscsökkentő aktivitást, a koleszterinszint és a lipidanyagcsere javulását, valamint az anyagcsere-betegségek megelőzését. Ezek a funkciók nagyon fontosak az érelmeszesedés elleni hatásban is. A BBR-t tartalmazó tápanyagok jelentősen csökkenthetik az idős statin-intoleráns hiperkoleszterinémiás betegek plazma LDL-C szintjét (Marazzi et al., 2011). Egy másik tanulmány kimutatta, hogy amikor alacsony dózisú sztatinokat és/vagy ezetimibet tartalmaz, a legtöbb szívkoszorúér-betegségben szenvedő, nagy dózisú statin-intoleráns beteg 3-6 hónapon belül elérheti a megcélzott LDL-C-szintet (Marazzi et al., 2019 ). Megjegyzendő, hogy a BBR terápiás hatása ezekre a gyulladásos és anyagcsere-betegségekre, mint például a kialakuló enyhe hasmenés (Yue és mtsai., 2019), a fekélyes vastagbélgyulladás (Cui és mtsai., 2018), az elhízás (Xie és mtsai., 2011; Zhang és mtsai., 2015), a hiperlipidémia (Wang és mtsai., 2017) és a cukorbetegség (Zhang és mtsai., 2012) összefüggésbe hozhatónak bizonyultak a bél mikrobiota szabályozásával.

Korábbi tanulmányok azt mutatták, hogy a BBR antiateroszklerotikus hatása összefüggésbe hozható a bél mikrobiotájának változásával, különösen a megnövekedett Akkermansia, megváltozott Firmicutes és Verrucomicrobia bőség, és csökkent a szérum trimetilamin N-oxid (TMAO) szintje (Zhu és mtsai, 2018; Shi és mtsai, 2018). A BBR szerepének a bél mikrobiotájában az ateroszklerózissal való összefüggése és a lehetséges mechanizmus azonban még mindig nem ismert. Ezért megvizsgáltuk a BBR (nagy és alacsony dózisok) bél mikrobiotára gyakorolt hatásának összefüggését az érelmeszesedés enyhítésével, ideértve a plakk területének javulását, a szérum lipidszintjét és a szisztémás gyulladást. A 16S rRNS szekvenálás és a metagenomikus elemzés eredményei azt mutatták, hogy a nagy és alacsony dózisú BBR antiateroszklerotikus hatása részben a bél mikrobiota összetételének és funkcióinak változásainak tulajdonítható, amelyek összefüggésben lehetnek a gyulladáscsökkentővel és az anyagcserével. glükóz és lipid.

Anyagok és metódusok

Állatmodell

Plakk elváltozás elemzése

Az aorta ívet tartalmazó szívszöveteket kivágtuk a proximális aorta gyökérből a csípő artéria ágába, és 4 órán át 4% paraformaldehid környezetbe helyeztük. Az aorta érelmeszesedéses elváltozásának területét a en face Olajvörös O festés a korábban leírtak szerint (Shi et al., 2018). Az elváltozás méretének mérése a paraffinba ágyazott aorta gyökér szakaszainak hematoxilin- és eozinfestésével történt. Az elváltozás területét és méretét vak megfigyelő elemezte az Image J szoftver segítségével.

A szérum lipidprofilok mérése

Az éjszakai éhgyomri után vérmintákat vettünk a retro-orbitális plexusból, centrifugáltuk, és a szérumot azonnal -80 ° C-on tároltuk. A TC, TG, LDL-C, nagy sűrűségű lipoprotein koleszterin (HDL-C), nagyon LDL-C (VLDL-C), lipoprotein (a) [Lp (a)], Apolipoprotein B100 (ApoB100) és Az Apolipoprotein A-1 (APOA-1) enzimatikus módszerekkel készült az AD2700 típusú automatizált biokémiai analizátorban (Olympus, Tokió, Japán).

Gyulladásos citokinek mérése

A szérum gyulladásos citokinek, köztük a TNF-a, az IL-1β, az IL-6, az IL-10 és az adiponektin (ADPN) szintjét ELISA készletek (Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság) segítségével mértük a gyártó utasításainak megfelelően. A nagy érzékenységű C-reaktív fehérje (Hs-CRP) szintjét nefelometriás immunvizsgálattal mértük.

Széklet DNS-extrakció és PCR-amplifikáció

Nagy teljesítményű szekvenálás és bioinformatikai elemzés

USEARCH (Edgar, 2010), QIIME v.1.9.1 (Caporaso és mtsai, 2010) és VSEARCH (Rognes és mtsai, 2016) szoftvereket alkalmaztunk a 16S rRNS génszekvencia feldolgozásához. A páros végű Illumina olvasmányokat a FastQC v.0.11.5 (Andrews, 2010) ellenőrizte minőségben, és a USEARCH-t használták a párosított végű olvasásokhoz való csatlakozáshoz és átnevezéshez. A vonalkódok és primerek eltávolítását és a minőségi szűrőt elvégeztük, és a nem redundancia-leolvasásokat eltávolítottuk. Az összes 16S rRNS kiméra szekvenciát kimutattuk és eltávolítottuk az UCHIME algoritmus segítségével az RDP Gold adatbázissal szemben (Edgar, 2013). A nem kiméra szekvenciákat bőség szerint szortíroztuk, és az UNOISE algoritmus (100% -os hasonlósági küszöb) alkalmazásával operatív taxonómiai egységekbe (OTU-kba) csoportosítottuk, alacsony bőségű szekvenciákat eltávolítva (nyolc szekvencia). Az OTU táblázatot VSEARCH szoftverrel állítottuk elő, és mindegyik OTU reprezentatív szekvenciáját RDP osztályozó algoritmus alapján osztályoztuk a SILVA128 adatbázissal, 70% -os megbízhatósági küszöbértékkel.

Könyvtárépítés és metagenomikus szekvenálás

A minősített DNS-kivonatot átlagosan 300 bp méretű töredékre törtük, körülbelül egy Covaris S220-mal (Covaris, Inc., MS, Egyesült Államok) a páros végű könyvtár építéséhez a NEBNext Ultra II DNS Library Prep Kit segítségével (NEB, Peking, Kína). ). A páros végű szekvenálást Illumina HiSeq4000-en (Illumina Inc., San Diego, Kalifornia, Egyesült Államok) végeztük, HiSeq 4000 Reagent Kits v2 felhasználásával, a gyártó utasításai szerint.

Szekvenciaminőség-ellenőrzés és genom-összeállítás

A SeqPrep 2-t alkalmazták az adapter szekvenciák elválasztására a párosított végek 3 és 5 végéről. Az elégtelen hosszúságú vagy minőségi értékű rossz minőségű olvasmányokat kiküszöbölte a Sickle 3. Az olvasmányokat a BWA 4 alkalmazásával igazítottuk a gazdaszervezet DNS-szekvenciáihoz, amely nagy összehangoltsággal távolította el a szennyezett olvasmányokat. A MEGAHIT-ot (Li et al., 2015) alkalmazták a metagenomikai adatok összegyűjtésére, és a végeredményként 300 bp-nál hosszabb összefüggéseket használtak.

Génjóslás, taxonómia és funkcionális megjegyzés

A MetaGene-t (Noguchi et al., 2006) alkalmaztuk az összeszerelt kontigok nyitott olvasási kereteinek (ORF) előrejelzésére. Az előre jelzett, 100 bp-nál hosszabb ORF-eket aminosavszekvenciákká alakították át az Országos Biotechnológiai Információs Központ (NCBI) fordítási táblázata szerint.

Az összes előre jelzett gént a CD-HIT (Fu és mtsai, 2012) segítségével csoportosítottuk (paraméterek: 95% azonosság, 90% lefedettség). A reprezentatív szekvenciákat az egyes klaszterek leghosszabb szekvenciái közül választottuk ki a nem redundáns génkatalógus összeállításához. SOAPaligner-t (Li et al., 2008) használtunk a minőségellenőrzés utáni leolvasások feltérképezéséhez a nem redundáns gének katalógusába, 95% -os azonossággal, és értékeltük a megfelelő minták génbőségét.

A nem redundáns génkatalógus reprezentatív szekvenciákat a BLASTP-n (2.2.28 + verzió) (Altschul et al., 1997) keresztül az NCBI NR adatbázishoz illesztettük (az e-értéket 1e –5-re csonkítottuk) (Altschul és mtsai, 1997), és további taxonómiai megjegyzéseket kaptunk. A KEGG annotáció meghatározásához BLASTP-t hajtottak végre a Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) adatbázissal szemben. A funkcionális annotációhoz az összehasonlítási eredmények alapján a KOBAS 2.0-t használtuk.

Statisztikai elemzések

Az adatokat átlag ± SEM-ben fejezzük ki. A 16S rRNS elemzés egy részét R szoftverben hajtottuk végre. Ezenkívül az ateroszklerotikus plakkok, a lipidek, a gyulladásos citokinek differenciálszintjét és a bél biológiai markereinek bőségét a nemzetség szintjén teszteltük egyirányú varianciaanalízissel (ANOVA), majd ezt követte a Sidak többszörös összehasonlító teszt. Kruskal-Wallis rangösszeg tesztet alkalmaztunk a funkcionális nemzetség és a KEGG útvonalak differenciális bőségének tesztelésére. A o-érték ∗∗∗ o ## o ### o 0,05) (2. ábra).

2. ábra. A berberin javítja a szérum lipidszintet a HFD-vel táplált ApoE -/- egerekben. (A) Teljes koleszterinszint, (B) triglicerid, (C) alacsony sűrűségű lipoprotein koleszterin, (D) nagy sűrűségű lipoprotein koleszterin, (E) nagyon alacsony sűrűségű lipoprotein koleszterin, (F) lipoprotein (a), (G) Apolipoprotein B100 és (H) Apolipoprotein A-1. Az adatokat átlag ± SEM-ben fejezzük kin = 12). A csoportok közötti különbségeket egyirányú ANOVA segítségével értékeltük. ∗ o ∗∗ o ∗∗∗ o # o ## o ### o 0,05). Ezenfelül ezen gyulladásos citokinek szintje szignifikánsan különbözött a magas és az alacsony csoport között (o 0,05) (3. ábra).

3. ábra. A berberin javítja a szisztémás gyulladást. (A-F) A TNF-α, IL-1β, IL-6, Hs-CRP, IL-10 és ADPN szérumszintje. Az adatokat átlag ± SEM-ben fejezzük kin = 12). A csoportok közötti különbségeket egyirányú ANOVA segítségével értékeltük. ∗ o ∗∗∗ o # o ### o 8) és nem baktérium szekvenciákat (például mitokondriumokat) 1085 OTU-t kaptunk mintánként átlagosan 25 801 szekvenciával (tartomány: 21 577–46 467), ami az összes szekvencia 75,3% -át teszi ki.

Az OTU táblázatot mintánkénti minimális olvasásszámra (21 577) normalizáltuk, majd elvégeztük a diverzitás összehasonlítását. Az alfa változatosság elemzése nem mutatott ki szignifikáns különbséget a bél mikrobiota változatosságában az egyes csoportok között a Chao 1 és a Shannon indexek alapján (o > 0,05) (4A, B ábra). A Bray Curtis távolságon alapuló PCoA-t alkalmaztuk a baktériumközösségek összetételeiben mutatkozó különbségek vizualizálására. A közösségi kompozíciós struktúra különbözött a négy csoportban, amelyek között a High és a Model, valamint az Low és a Model csoportok szignifikánsan különböztek (o ∗ o ∗∗ o 0,2%. Összesen 116 bakteriális OTU-t választottak ki, és az összes reprezentatív szekvenciát felhasználták egy ML-fa készítéséhez (S1 kiegészítő ábra). A nemzetség szintjén 116 OTU volt feljegyezve, színtartományokkal azonosítva azt a törzset, amelyhez az OTU-k tartoztak. Ezek az OTU - k főleg a Firmicutes és a Bacteroidetes családban terjedtek el, és Lachnospiraceae_NK4A136_csoport és nem kijelölt nemzetség. A hőtérképet használták az OTU-k relatív bőségének feljegyzésére, és a nagyobb bőségű OTU-k főleg Allobaculum, Bacilus, Lachnospiraceae_NK4A136_csoport, Blautia, stb. A legkülső réteget kör annotációkkal egészítették ki családi szinten.

7. ábra. (A) A KEGG útvonalak LEfSe elemzése az 1. szinteken (LDA> 2,5, P 0,05). A butirátot két acetil-CoA molekula kondenzációjával állítják elő, majd butiril-CoA-vá redukálják, amelyet ezt követően a klasszikus úton butiráttá alakítanak át (Koh et al., 2016). Megállapították, hogy az acetil-CoA-hidroláz (K01067) jobban dúsul a modellcsoportban, mint a nagy dózisban (o ### o 0,05, 9C, D ábra).

9. ábra. A bélben lévő mikrobiális KO-k bőségkülönbségei a TMAO előállításához. ** o # o -/- egerek. Megfigyeltük a lipid- és gyulladásos citokinek szérumszintjének változását, valamint a bél mikrobiota összetételének szerkezetét és funkcióit, miután a BBR különböző dózisaival kezeltük, és ezeket a változásokat korreláltuk az érelmeszesedéssel. A BBR-kezelés gyengítette a HFD által kiváltott érelmeszesedést, csökkentette az érelmeszesedéses plakkokat és az elváltozások területét, és javította a szérum lipidek és gyulladásos citokinek szintjét. A BBR magas dózisának hatásai jelentősebbek voltak, mint az alacsony dózis hatásai. A 16S rRNS amplikon szekvenálás azt mutatta, hogy a BBR szignifikánsan megváltoztatta a bél mikrobiota közösségi összetételét, és a BBR különböző dózisai eltérő változásokat mutattak. A környezeti tényező és a metagenomikus funkció további elemzése megmutatta a BBR hatásait a bél mikrobiotájában a gyulladásra, a glükóz és lipid anyagcserére, valamint a TMAO termelésre.

A megemelkedett lipidszint az ateroszklerotikus CVD fő kockázati tényezője. Mivel Kong et al. (2004) a BBR-t új koleszterinszint-csökkentő gyógyszerként azonosította (Kong et al., 2004), a BBR diszlipidémiára gyakorolt terápiás hatását megerősítették és tovább kutatták az elmúlt években (Kong et al., 2008; Zhang et al., 2008). A diszlipidémiás betegeknél és a hiperlipidémiás egereknél végzett vizsgálatok azt mutatták, hogy a BBR szignifikánsan csökkentette a szérum TC, TG és LDL-C szintjét (Kong és mtsai, 2004; Zhang és mtsai, 2008). Ezen túlmenően ezeket az eredményeket két metaanalízis is alátámasztotta (Lan et al., 2015; Ju et al., 2018), amelyek szintén a HDR-C szintjének emelkedéséről számoltak be a BBR kezelés után. A jelenlegi eredmények azt mutatták, hogy a BBR magas és alacsony dózisa egyaránt szignifikánsan csökkentette a TC, APOB100 és VLDL-C szintjét, míg a TG, HDL-C, LDL-C és LP (a) szint csak a High csoportban csökkent. Eredményeink nem mutatják a HDL-C növekedését a BBR kezelés után. Az APOA-1 antiaterogén hatású, és az APOA-1 injekciója csökkentheti az intracelluláris koleszterinszintet az ApoE -/- egerekben (Pourcet és Staels, 2016; Gaddis et al., 2018). Vizsgálatunkban azonban nem volt szignifikáns növekedés a csökkent APOA-1 szintekben az ateroszklerózis egerekben, a BBR magas vagy alacsony dózisát alkalmazva.

Vizsgálatunknak vannak bizonyos korlátai. Figyelembe véve azt a tényt, hogy a minta mennyisége viszonylag kicsi, az eredmények meggyőzősége korlátozott. Noha a 16S rRNS szekvenálás és a metagenomikus elemzés alapján kifejtettük a BBR bél mikrobiotára gyakorolt szabályozó hatása és az érelmeszesedés csökkentése közötti összefüggést, további bélsár baktériumtranszfer kísérletekre van szükség annak érdekében, hogy tisztázzuk a BBR közvetlen kapcsolatát a bél mikrobiotáján az érelmeszesedéssel. Ezt a vizsgálatot ApoE -/- egereken végezték HFD-vel. A jövőbeni tanulmányban ki kell terjesztenünk a klinikai atherosclerosisban szenvedő betegeket, hogy tovább vizsgáljuk a BBR hatását a bél mikrobiotájára és az ateroszklerózisra.

Következtetés

Összefoglalva, mind a nagy, mind az alacsony dózisú BBR javíthatja a szérum lipid- és gyulladásszintjét, és enyhítheti az érelmeszesedést a HFD által kiváltott érelmeszesedés egérmodelljében. A BBR ezen atherosclerotikus hatása részben a bél mikrobiota összetételének és funkcióinak változásainak tulajdonítható, amelyek összefüggésben lehetnek a gyulladáscsökkentő aktivitással, valamint a glükóz és a lipid metabolizmusával. Ezenkívül a BBR különböző dózisainak eltérő hatásai voltak, amelyek között az ateroszklerózis gyengülése nyilvánvalóbb volt a BBR magas dózisánál, de a bél mikrobiotájában az összetétel és a funkciók változása eltérő érzékenységet mutatott a BBR dózisra.

Adatelérhetőségi nyilatkozat

Az ehhez a tanulmányhoz generált adatkészletek megtalálhatók az NCBI Sequences Read Archive adatbázisában, PRJNA579048 csatlakozási szám alatt.

Etikai nyilatkozat

Az állatkísérleteket a Pekingi Egyetem Állattenyésztési Bizottsága felülvizsgálta és jóváhagyta.