Kiegészített, magas zsírtartalmú, alacsony szénhidráttartalmú étrend a glioblastoma kezelésére

Keresse meg ezt a szerzőt a Google Tudósban
Keresse meg ezt a szerzőt a PubMed oldalon
Keresse meg ezt a szerzőt ezen a webhelyen
Levelezés céljából: b.a.reynolds @ gmail.comloic.deleyrolle @ neurosurgery.ufl.edu

Absztrakt

Célja: A szabályozatlan energetika és az ellenőrizetlen proliferáció együttvéve a rák jellemzőjévé vált, ami fokozott érdeklődést eredményezett a metabolikus terápiák iránt. A glioblastoma (GB) erősen rosszindulatú, metabolikusan nagyon aktív és tipikusan ellenálló a jelenlegi terápiákkal szemben. A glükózmegvonáson alapuló étrendi kezelési lehetőségeket korlátozó ketogén étrend (KD) alkalmazásával vizsgálták, pozitív rákellenes jelentésekkel. A negatív mellékhatások és az íze hiánya azonban megnehezíti a KD alkalmazását egy felnőtt populációban. Ezért kidolgoztunk egy kevésbé szigorú, kiegészített, magas zsírtartalmú, alacsony szénhidráttartalmú étrendet, amely utánozza a KD metabolikus és daganatellenes hatásait, stabil táplálkozási profilt tart fenn, és alternatív klinikai lehetőséget kínál a különféle betegcsoportok számára.

Kísérleti terv: Az étrendi paradigmát in vitro és in vivo teszteltük, több betegből származó gliomaszféra vonal felhasználásával. A sejtszaporodást, a klonogén gyakoriságot és a tumor őssejt populációs hatásait in vitro határoztuk meg a neuroszféra assay (NSA) alkalmazásával. A tumorellenes hatékonyságot in vivo tesztelték preklinikai xenograft modellekben, és feltárták az mTOR útvonalon keresztüli mechanikus szabályozást.

Eredmények: Az in vitro glükóz fiziológiai szintre történő csökkentése ketonpótlással párosulva gátolja a GB-sejtek szaporodását és csökkenti a tumor őssejtjeinek terjeszkedését. In vivo, az állatok egészségének megőrzése mellett, az sHFLC étrend jelentősen csökkenti a tumorsejtek növekedését a tumor progressziójának szubkután modelljében, és növeli a túlélést egy ortotóp xenograft modellben. Az étrend által közvetített rákellenes hatások korrelálnak az mTOR effektor expresszió csökkenésével.

Transzlációs relevancia

Az anyagcsere kialakuló szerepe számos ráktípusban új célt szolgál az új terápiák számára. Lehetséges olyan étrendi terápiák, amelyek célja a tumorsejtek egyedi energetikai igényeinek kihasználása. Az egyik ilyen lehetőség egy nagyon magas zsírtartalmú és alacsony szénhidráttartalmú étrend (90%: 5%, ill. 5%) alkalmazása, amelyet Ketogén étrendnek (KD) neveznek. Ezt az étrendet közel 90 éve használják epilepszia kezelésére, és nemrégiben feltárták rákterápiás alkalmazását. Bár a preklinikai vizsgálatok bizonyítják hatékonyságát, és a klinikai esetjelentések alátámasztják megvalósíthatóságát, a KD-t szigorú jellege miatt nehéz végrehajtani. Itt egy sHFLC kialakulásáról számolunk be, amely utánozza a KD fő fiziológiai hatásait, nevezetesen a csökkent glükózt és a megnövekedett ketonokat. Ezenkívül az sHFLC diéta képes csökkenteni a glioblastoma (GB) tumorsejtek szaporodását és meghosszabbítani az élettartamot GB állatmodellekben.

Bevezetés

A glioblastoma (GB) a leggyakoribb magas fokú glioma felnőtteknél, rendkívül rossz prognózissal. A csápszerű vetületek és a pseudopalisading necrosis beépül a normális agyszövetbe, ami megnehezíti a teljes műtéti reszekciót. Az extrém sejtheterogenitás, a kiterjedt genetikai rendellenességek és a nem megfelelő korai felismerés a GB hatékony és hosszú távú ellenőrzését teszi kihívássá. A jelenlegi ellátási színvonal (SOC) a műtétre, a sugárzásra és a kemoterápiára (temozolomid/TMZ) korlátozódik, a medián túlélés 9-12 hónap, az 5 éves túlélés pedig kevesebb, mint 5% (1).

A glükóz-anyagcsere és a Warburg-effektus potenciális tumorgyengeségként és kiaknázható kezelési területté vált. Ahol a normál sejtek glükózt használnak a magas hozamú energiatermeléshez a mitokondriumokban (1: 36ATP), a daganatsejtek magasabb glükózszintet igényelnek a csökkent energiatermelés érdekében, a citoszolban lévő laktát (1: 4ATP) és a pentóz-foszfát útvonal nukleotidszintézise révén . Ez az anyagcsere-jellegzetesség, amelyet Warburg-effektusnak hívnak, a gyors sejtszaporodás elengedhetetlen mellékterméke, és a tumorgenezis során elősegíti onkogén metabolikus átprogramozással. Ezért a daganatsejtek képesek fenntartani a proliferatív jelátviteli mechanizmusokat, ami ezt követően elősegíti a rosszindulatú glikolízist (2). A PI3K/Akt/mTOR útvonal központi szerepet játszik az emberi rákos megbetegedésekben a konstitutív aktivitás, a megnövekedett növekedési faktor expresszió és a glikolitikus aktiváció révén, ami a glükózfogyasztás, a proliferáció és a túlélés előremenő hurkait eredményezi (3). A PTEN, a PI3K/Akt/mTOR út kulcsszabályozója gyakran GB-ban inaktiválódik.

A szabályozatlan sejtanyagcsere kutatása felvetette azt a felfogást, hogy a rákos betegek étrendi terápiája jelentős klinikai haszonnal járhat. A GB-t az étrendi beavatkozás ígéretes jelöltjének javasolták a glükóz jelentős támaszkodása és felhasználása miatt (4, 5). Az étrendi rákellenes terápia élén a ketogén étrend áll, amely magas zsírtartalmú, alacsony szénhidráttartalmú és alacsony fehérjetartalmú étrend, amelyet évtizedek óta alkalmaznak a refrakter epilepsziás rohamok kezelésére. Az extrém szénhidrát-korlátozás éhomi állapotot utánoz, ami a vércukorszint csökkenését és a ketontestek indukcióját eredményezi (pl. Β-hidroxi-butirát/BHB; 6. hivatkozás). A ketontestek megfelelő energiapótlók a funkcionális mitokondriumokkal rendelkező normál sejtek számára (7), de bebizonyosodtak, hogy alkalmatlanok a tumorsejtek számára (8,9), mivel a tumorsejtek mitokondriális funkciói nem szabályozottak (10). A meglévő preklinikai adatok alátámasztják a KD-t (11–13) és a kalóriatartalmú KD-t (RKD; hivatkozások 14, 15) az agyrák kezelésében a daganat növekedésének csökkentésével és az állatok túlélésének növelésével. Klinikai jelentések (5), esettanulmányok (16, 17) és kísérleti kísérletek (18–20) bebizonyították, hogy a KD biztonságos, alacsony toxicitású és rákos betegeknél alkalmazható.

Ezek a publikációk megjegyzik, hogy a rákkezelésben történő alkalmazásának akadályai vannak a hosszú távú használatra való nemkívánatos miatt, néhány enyhe vagy súlyos mellékhatásról számol be (21). Javasolták, hogy tartósabb étrendet kell kidolgozni és tesztelni, mivel nem minden beteg tolerálja ugyanazokat az étrendi korlátozásokat (22). Ezért egy kevésbé korlátozó KD-szerű étrend kidolgozására törekedtünk, amely ugyanazt a fiziológiai fenotípust és tumorellenes hatékonyságot mutatná be. A magas zsírtartalmú, alacsony szénhidráttartalmú (sHFLC), mérsékelt fehérjetartalmú étrend kiegészítésével speciális közepes láncú trigliceridekkel [MCT; 60% (30%): 30%: 10%: Zsír (MCT): Protein: Carb], feltételezzük, hogy kiegyensúlyozottabb étrend valósítható meg, ami a tumor progressziójának csökkenését eredményezi. Az MCT-ket kifejezetten a szénlánc-hosszúság (C8: C10: 97%: 3%) alapján választották meg, amelyek lehetővé teszik számukra, hogy gyorsan diffundálódjanak a gyomor-bél traktusból a máj portál rendszerébe, és közvetlenül a májba utazzanak, ahol keton testekké alakulnak át. (6) Úgy gondoljuk, hogy táplálkozásilag teljesebb, rugalmasabb és ízletesebb rákellenes étrendet lehet biztosítani az sHFLC segítségével, amely sokféle betegpopulációt célozhat meg, és növelheti a betegek megfelelését.

Anyagok és módszerek 1

Sejtek

A páciens glioblastoma tumorait disszociálták és tenyésztették a korábban publikáltak szerint (23). Az összes vonal STR-profilozással lett tesztelve és hitelesítve az ICLAC protokollok szerint. A táptalajok szérummentesek, 20 ng/ml koncentrációjú EGF-mel kiegészítve. A glükózzal korlátozott táptalajokat glükométerrel teszteltük és kiegészítettük glükózzal a lemezezéskor és minden másnap a 7 napos átjárási ciklus során. A BHB-t a táptalajban csak a lemezezés napján adtuk be, majd az 1. és a 7. napon mértük a OneTouch mérővel.

Képek

A gömb kialakulása után a sejteket PFA-val rögzítettük, DAPI-val festettük és Leica DM 2000 2,5 × fluoreszcens mikroszkóppal képeket készítettünk. A képeket Macnifikáció segítségével számszerűsítettük.

Állatok

Az összes kísérletet az IACUC jóváhagyta. A NOD/SCID állatokat standard állattenyésztési eljárásokkal helyeztük el. Transzplantációk: Az állatokat korábban közzétett protokollok szerint ültették át (24). A szubkután xenograftokhoz disszociált gliomasferákat ültettünk át (1 × 106). 15 × 15 mm (1766 mm 3) végpont kritériumokat használtunk. A koponyán belüli xenograftok esetében az állatokat sztereotaktikusan disszociált glioma gömbökkel (2 × 105) injektáltuk a striatumba (2 ml és 2,5 DV). A végpont kritériumai a testtömeg> 20% -os csökkenése, a BCS ≤2 és a neurológiai hiányosságok voltak.

Diéta készítés és szállítás

A ketogén étrendet a Bioserv # F3666 számú újrakészítéssel készítették el. Az sHFLC és a kontroll étrendeket a Purina Test Diet összetevőinek felhasználásával hoztuk létre. Az sHFLC diéta végső kalória% -a 10:30:30 (30) volt szénhidrát: fehérje: zsír (MCT-k; 3,2: 2,8: 1 zsírok: fehérje: szénhidrát). Az sHFLC diéta 5,66 kcal/g bruttó energiát szolgáltatott, ahol a zsír, a szénhidrátok, a fehérje és a rost 404 g/kg, 125 g/kg, 355 g/kg, 73,12 g/kg volt. A kontroll étrend kalóriaszázaléka 55:20:25 volt szénhidrát: fehérje: zsír (1: 1,8: 4,9 zsír: fehérje: szénhidrát). A kontroll étrend 4,67 kcal/g bruttó energiát adott, ahol a zsír, a szénhidrátok, a fehérje és a rost 115 g/kg, 570 g/kg, 208 g/kg, 72 g/kg volt. Az ételt (ad libitum) naponta cserélték. SC daganat tapintása után (1 × 1 mm) állatokat randomizáltak, és hozzájuk rendelték a megfelelő étrendet. A koponyán belüli állatokat a transzplantáció után randomizálták, és 5 nappal az utolsó transzplantáció után megfelelő étrendet rendeltek hozzájuk.

Daganatok foglaltsága

A tumor foglaltságának számszerűsítését ImageJ alkalmazásával határoztuk meg. Minden agyhoz három képet (4 kontroll, 3 sHFLC, 3 KD) készítettünk a tumor rostralis, medialis és caudalis helyzetéből.

A szövetet formaldehiddel fixáltuk, mélyhűtött állapotban vagy paraffinba ágyazottuk. A metszeteket blokkoltuk és primer antitestben inkubáltuk egy éjszakán át 4 ° C-on. Fluoreszcens szekunder antitestet 1 órán át szobahőmérsékleten alkalmaztunk. A tárgylemezeket DAPI-val ellátott VectaShield segítségével fedjük le. Biotinilezett szekunder antitestet 2 órán át szobahőmérsékleten alkalmaztunk, majd 1 órás Vectastain Elite ABC kitet és DAB peroxidáz készletet. A tárgylemezeket Cytoseal-szal fedtük le.

Western blot elemzés

A fehérjéket szubkután daganatokból extraháltuk és Qubit alkalmazásával számszerűsítettük. Minden egyes üregbe azonos mennyiségű fehérjét töltöttünk (20–40 μg). A géleket 30 percig 200 V feszültségen futtattuk, majd xCell-II blot modul segítségével (1 óra, 35A, RT) átvisszük. A kérdéses fehérjéket kemolumineszcencia alkalmazásával detektáltuk. A membránokat kitettük (Kodak), lecsupaszítottuk és megvizsgáltuk az aktint.

Áramlási citometria

A tenyészet sejtjeit és az SC tumorok ex-vivo sejtjeit BD Biosciences LSRII áramlási citométeren futtattuk. Röviden: 0,5x106 sejtet blokkoltunk, permeabilizáltunk és primer antitestekkel inkubáltunk egy éjszakán át 4 ° C-on. Szekunder antitestet 1 órán át szobahőmérsékleten alkalmaztunk. Az áramláselemzést FlowJo szoftverrel végeztük.

RNS izolálás és RT 2 PCR humán mTOR Profiler

Az összes RNS-t izoláltuk SC daganatokból RNeasy Plus Mini RNS izolációs készlet alkalmazásával. Az RT 2 első szálakat és az RT 2 SYBR Green ROX qPCR Mastermix-et használtuk. Az RT-PCR-t Qiagen (PAHS-098ZE-4) alkalmazásával, ABI 7900HT-on hajtottuk végre. A háztartási géneket a NormFinder segítségével határoztuk meg.

Eredmények

A korlátozott glükóz lassítja a beteg eredetű gliomaszférák szaporodását

Az sHFLC diéta csökkenti az mTORC1/2 jelátvitelt. A, a Qiagen RT 2 Profiler 78 kiválasztott mTOR-asszociált génjének klasztergrammja 86 kulcs mTOR génnel. A klasztergram színgradiense az mTOR útvonal következetes szabályozását mutatja. A Clustergram négy különböző állatdaganatot tartalmaz a kontroll és az sHFLC-vel táplált csoportokból. Az elemzett daganatokat szubkután transzplantált betegből származó 0-as vonal gliomasférainak vetették alá. B, funkcionális halmazokba csoportosítva a kiválasztott mTORC1/2 szubsztrát gének szignifikáns P értékeinek táblázata. A háztartási géneket a NormFinder segítségével határoztuk meg és a Qiagen elemző szoftver segítségével normalizáltuk. A statisztikákat Student t teszt segítségével végeztük.

Munkánk bizonyítja, hogy az anyagcsere és a szaporodás között egyértelmű összefüggés van, amelyet ki lehet használni a test energiaforrásainak megváltoztatásával. A metabolikus köztitermékek biokémiai reakcióinak további kutatása fény derülhet arra, hogy a keton testeket hogyan használják fel különböző módon a tumorsejtek, mivel a mitokondriumok szerepe a tumor terjedésében és a karcinogenezisben sokrétű és hiányosan megértett. Mindazonáltal hatékonyan megmutatjuk, hogy az alacsony glükózszint és a magas ketonok kombinációja negatív proliferatív hatásokat eredményez a gliomaszférákon, amelyek in vivo lefordíthatók az sHFLC étrenddel. Ez a diéta csökkenti a daganatok általános terhelését és növeli a túlélést, ami szigorú 1: 6 KD-vel egyenértékű, és teljes táplálkozási profillal rendelkezik. Ezért azt javasoljuk, hogy az étrendi terápia, például az sHFLC étrend alkalmazható legyen a GB kezelésében.

A lehetséges összeférhetetlenség nyilvánosságra hozatala

Potenciális összeférhetetlenséget nem hoztak nyilvánosságra.

A szerzők közreműködése

Koncepció és tervezés: R.T. Martuscello, V. Vedam-Mai, C.L. Skinner, L. P. Deleyrolle, B. A. Reynolds

Módszertan kidolgozása: R.T. Martuscello, C.L. Skinner, O. Suslov, L. P. Deleyrolle, B. A. Reynolds

Adatgyűjtés (biztosított állatok, megszerzett és kezelt betegek, biztosított létesítmények stb.): R.T. Martuscello, D.J. McCarthy, M. Schmoll, C.D. Louviere, B. Griffith, C.L. Skinner, B.A. Reynolds

Az adatok elemzése és értelmezése (pl. Statisztikai elemzés, biostatisztika, számítási elemzés): R.T. Martuscello, V. Vedam-Mai, M.A. Jundi, C.D. Louviere, L. P. Deleyrolle, B. A. Reynolds

A kézirat megírása, áttekintése és/vagy átdolgozása: R.T. Martuscello, V. Vedam-Mai, L. P. Deleyrolle, B. A. Reynolds

Adminisztratív, technikai vagy anyagi támogatás (azaz adatszolgáltatás vagy -rendezés, adatbázisok összeállítása): R.T. Martuscello, D.J. McCarthy, C.D. Louviere, O. Suslov, L. P. Deleyrolle, B. A. Reynolds

Tanulmányi felügyelet: V. Vedam-Mai, L. P. Deleyrolle

Egyéb (Regina Martuscello nyújtotta be a kéziratban szereplő összes képre vonatkozóan): B.A. Reynolds

Támogatás

Ezt a munkát anyagilag támogatta a McKnight Brain Institute, az Idegsebészeti Osztály (BA Reynolds-hoz), Florida Agydaganatkutató Központ (BA Reynolds-hoz), National Brain Tumor Society (BA Reynolds-hoz), NIH - NINDS R24 NS086554-01 ( BA Reynolds), NIH/NCI - R21 CA141020-01 (BA Reynolds részére) és az American Cancer Society Chris DiMarco intézményi kutatási támogatás (LP Deleyrolle-nak).

Köszönetnyilvánítás

A szerzők köszönetet mondanak a B.A.R labor minden tagjának és az egyetemisták önkénteseinek a segítségért, nevezetesen Andrew Naplesnak, James McGuinessnek, Lindsey Chasonnak, Hunter Futchnak és Gretter Diaznak. A szerzők köszönetet mondanak finanszírozási forrásaiknak és a McKnight Brain Institute áramlási citometriájának, valamint a sejt- és szövetanalízis magnak (CTAC) is, a Floridai Egyetem Orvostudományi Főiskolán és az Orvostudományi Interdiszciplináris Program mellett Barbara Frentzen és az agydaganatok mintáinak FCBTR-je.

Lábjegyzetek

Jegyzet: A cikk kiegészítő adatai a Clinical Cancer Research Online webhelyen érhetők el (http://clincancerres.aacrjournals.org/).

↵ 1 A részletes kísérleti eljárásokat lásd a kiegészítő módszerek fájlban.