Határok az immunológiában

Molekuláris veleszületett immunitás

Ez a cikk a kutatási téma része

Nano- és mikrorészecskék által kiváltott sejtpusztulás, gyulladás és immunreakciók Az összes 21 cikk megtekintése

Szerkesztette
Uday Kishore

Brunel University London, Egyesült Királyság

Felülvizsgálta
Lubka T. Roumenina

INSERM U1138 Centre de Recherche des Cordeliers (CRC), Franciaország

Robert B. Sim

Oxfordi Egyetem, Egyesült Királyság

A szerkesztő és a lektorok kapcsolatai a legfrissebbek a Loop kutatási profiljukban, és nem feltétlenül tükrözik a felülvizsgálat idején fennálló helyzetüket.

hosszú

  • Cikk letöltése
    • PDF letöltése
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Kiegészítő
      Anyag
  • Exportálás
    • EndNote
    • Referencia menedzser
    • Egyszerű TEXT fájl
    • BibTex
OSZD MEG

Eredeti kutatás CIKK

  • 1 Nephrologisches Zentrum, Medizinische Klinik und Poliklinik IV, Klinikum der Universität München, München, Németország
  • 2 Nefrológiai Tanszék, Patológiai Intézet, Aacheni RWTH Egyetem, Aachen, Németország
  • 3 DWI-Leibniz Interaktív Anyagok Intézete, Aachen, Németország
  • 4 Gyulladás- és immunológiai osztály, Humanitas Klinikai és Kutatóközpont, Rozzano, Olaszország
  • 5 Orvostudományi Tanszék, Humanitas Egyetem, Pieve Emanuele, Olaszország

Bevezetés

A Pentraxinok immunreguláló akut fázisú fehérjék, amelyeket a homeosztázis megszakadása indukál (1). A rövid pentraxinokat, a C-reaktív fehérjét és a szérum amiloid P-t hepatocitákban szintetizálják az IL-6 hatására. A C-reaktív fehérje és a szérum amyloid P számos mikroorganizmushoz, elhalt sejthez és más részecskéhez kötődve opszoninokként működik, megkönnyítve a komplement által közvetített gyilkolást vagy a fagocitózist (2). A rövid pentraxinokkal ellentétben a hosszú pentraxin PTX3-ot a fertőzés és a gyulladás oldalán számos immun- és nem-immunsejt termeli és szabadítja fel, beleértve a neutrofileket, a makrofágokat, a myeloid dendritikus, az endotheliális és az epithel sejteket a gyulladásos citokinek (pl., IL-1β és TNF-a) és Toll-szerű receptor agonisták (3, 4). Fontos, hogy a PTX3 expresszióját dokumentálták az egér uroepitheliumában az uropatogén folyamat során E. coli (UPEC) fertőzések, ahol a veleszületett immunsejtek fokozzák az UPEC fagocitózisát (5). Valójában e pentraxin számos immunszabályozó funkciója között az opszonikus tevékenység alapvető szerepet játszik az extracelluláris részecskék (azaz mikrobiális részek) felismerésében és fagocitózisának elősegítésében makrofágok, neutrofilek és dendritikus sejtek által (6–10).

A szérumfehérjék, például az albumin, valamint az alfa-globulinokat és a béta-globulinokat tartalmazó plazmafrakciók sokféle mechanizmus révén gátolják a CaOx kristály aggregációt (31, 32). Nemrégiben megfigyeltük, hogy a humorális immunhatás és az opsonin immunglobulin G is gátolja a CaOx kristály növekedését in vitro (33) Nagy molekulatömegük miatt sem az albumin, sem az IgG nem lépi át a szűrési gátat, ezért egészséges egyéneknél és kőképzőknél nem képezik a glomeruláris ultraszűrő vagy vizelet alkotórészét. Ezért feltételeztük, hogy egy opsonin, például a PTX3, amelyet valószínűleg tubuláris hámsejtek expresszálnak (azaz túlmutatnak a vesefiltrációs gáton), és ezért közvetlenül felszabadul a vizeletbe (5), a CaOx kristály endogén inhibitoraként működhet aggregáció a vese tubulusokban. Ezáltal a PTX3 korlátozhatja a nephrocalcinosist a hyperoxaluria során, ezt a hipotézist alátámasztják a jelen tanulmányban bemutatott és tárgyalt bizonyítékok.

Eredmények

A rekombináns humán PTX3 gátolja a túltelítettség által kiváltott CaOx kristály aggregációt

A CKD-kutatásokhoz - a csak a kristályos patológiákban megtalálható egyedi patomechanizmusoktól eltekintve - a modell törzse és nemi függősége rámutat arra, hogy a kutatóknak nagy körültekintéssel kell eljárniuk olyan genetikailag módosított organizmusok alkalmazásakor, amelyek különböző háttérből származnak, vagy nem teljesen keresztbe helyezve. Ez nem csak a hiperoxaluria által kiváltott nephrocalcinosisra vonatkozik, hanem számos más vese gyulladásos modellre és állapotra, például a tioglikolát által kiváltott peritonitisre (58), a gyulladásos válaszra és az albuminuriara az albumin-túlterhelés hatására (59), anti-GBM glumerulonephritis (60), valamint a nephrotoxinokra adott válasz (61).

Összefoglalva, az opszoninin és az immunszabályozó PTX3 szintén modulálja a CaOx kristály aggregációt és a tubuláris sejtmembránokhoz való tapadást, és ezért a nephrocalcinosis, valamint az urolithiasis vagy más kristályos kórképek számos endogén gátlója.

Anyagok és metódusok

Állatkísérletek

A BALB/c, C57BL/6N és CD-1 egereket a Charles River Laboratories-tól (Sulzfeld, Németország) vásároltuk. Ptx3-hiányos egerek a B6; 129 háttérből Alberto Mantovani/Charles River Olaszországból származnak, és az előbb leírtak szerint generálódnak (62). Az egereket ötfős csoportokban helyeztük el szűrő felső ketrecekben, korlátlan hozzáféréssel az élelemhez és a vízhez. A ketreceket, fészket, ételt és vizet felhasználás előtt autoklávban sterilizáltuk. Nyolc-tizenkét hetes hím egereket használtunk kísérletekhez. Az oxalát diétát úgy készítettük, hogy 50 μmol/g nátrium-oxalátot adtunk egy kalciummentes standard étrendhez (Ssniff, Soest, Németország), a korábban leírtak szerint (43, 63). Az egereket a 7., 14. és 21. napon feláldoztuk az oxalát diéta megkezdése után. Plazma- és vizeletmintákat gyűjtöttünk, és a GFR-t különböző időpontokban mértük a méhnyak diszlokációja előtt. A vizeletet azonnal megsavanyították az oxalátbecsléshez, vagy 10 percig 10 000 g-vel centrifugáltuk a sejtkomponens eltávolításához, és -80 ° C-on tároltuk. Minden vese egyik részét formalinban rögzítették, majd szövettani elemzés céljából paraffinba ágyazták. Az összes kísérleti eljárást a helyi önkormányzatok jóváhagyták.

A vesekárosodás értékelése

A 2 μm-es vese szakaszokat periodikus sav-Schiff (PAS) reagenssel festettük, és a tubuláris sérülést a nekrotikus tubulusok százalékos arányának és a tubulusos gipszek jelenlétének értékelésével értékeltük. Pizzolato festését alkalmaztuk a CaOx kristályok vizualizálására, és a kristálylerakódás képződését a vesében a leírásnak megfelelően értékeltük (43). A fibrotikus területeket az aSMA (Dako GmbH, Németország) és az I kollagén (Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság) immunfestésével azonosítottuk. A kristályadhéziós molekulák, például a CD44 és az Annexin II expresszióját a CD44 és az Annexin II immunfestésével azonosítottuk (mindkettő Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság). A PTX3 expressziót paraformaldehiddefixált és krio-vágott szövetmintákban azonosítottuk poliklonális nyúl anti-humán PTX3 antitest alkalmazásával (Enzo Life Sciences, Farmingdale, USA).

A Pizzolato ezüstfoltjának és immunfestéseinek számszerűsítését Image J szoftver segítségével végeztük. Az összes értékelést egy megfigyelő végezte, aki megvakult a kísérleti állapottól. A plazma BUN-, kreatinin- és foszforszinteket Cobas Integra 800 autoanalizátorral (Roche, Mannheim, Németország) mértük.

A C57BL/6N, BALB/c és CD-1 állatokban a PTX3 festés szignálintenzitásának értékelése nem volt megvalósítható ImageJ alkalmazásával, mivel a kriozekciókban nagy kalcium-oxalát kristálylerakódások voltak láthatóak, és ugyanolyan kontrasztot mutattak, mint az immunfestés. Ennélfogva a PTX3 festést félkvantitatívan értékeltük egy pontozási rendszer alkalmazásával, ahol egy erős pozitív jelet 2-es értékkel, egy gyenge jelet 1-es értékkel és a jel hiányát 0-val értékeltünk. Ezt az értékelést függetlenül egy vese szakasz kérge, medulla és papillája, valamint az összesített pontszám az összes érték összegéből származott, esetleg 0 és 6 között tombolt.

A glomeruláris szűrési sebesség (GFR) transzkután mérése tudatos egerekben

A GFR méréséhez az egereket izofluránnal altattuk, és két fénykibocsátó diódából, egy fotodiódából és egy elemből (MediBeacon, Mannheim, Németország) épített miniatürizált képalkotó eszközt kétoldalas ragasztószalag segítségével szereltünk fel a borotvált állatok nyakára (64). ). A felvétel időtartamára (

1,5 óra) mindegyik állat eszméleténél volt, és egyetlen ketrecben tartották őket. 150 mg/kg FITC-sinistrin (MediBeacon, Mannheim, Németország) intravénás injekciója előtt 5 percen keresztül rögzítettük a bőr háttérjelét. A képalkotó eszköz eltávolítása után az adatokat MPD Lab szoftverrel (MediBeacon, Mannheim, Németország) elemeztük. A GFR-t [μl/perc] a fluoreszcencia intenzitás időbeli csökkenése (azaz a FITC-sinistrin plazma felezési ideje) csökkenése alapján számítottuk ki, kétkamrás modell, az állatok testtömege és empirikus konverziós tényező segítségével (64.

Intrarenális kristályok röntgendiffrakciós elemzése

A fagyasztva szárított egér veseszövet röntgenpor-diffrakcióval történő elemzését a PANalytical cég Empyrean rendszerével végeztük. Egy Cu röntgencső (12 × 0,04 mm2 vezetékforrás) l = 0,1542 nm CuKa sugárzást biztosított. A Kb vonalat Ni szűrővel eltávolítottuk. A forrás és az érzékelő függőleges irányban mozgott egy rögzített vízszintes minta körül. 1/8 ° -os divergencia rés és 1/4 ° anti-scatter rés áthaladása után a nyaláb elérte a mintát a phi-chi-z szakasz közepén. Az alkalmazott Bragg-Bretano geometriában a nyalábot 1/4 ° -os szekunder divergencia résen újrafókuszálták. Végül a jelet pixel detektorral (256 × 256 pixel, 55 μm) rögzítettük a 2θ szórási szög függvényében. Ezt követően a csúcspozíciókat a következőképpen számoltuk: q = 2π /d = (4π/λ) sinθ, amelyben q a szórásvektor. A detektort olyan pásztázó geometriában használták, amely lehetővé tette az összes sor egyidejű használatát.

Áramlási citometria

Az egész vesét felaprítottuk és emésztettük 30 percig 37 ° C-on, kollagenáz és DNáz I oldat alkalmazásával (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Németország). A mintákat tovább szűrjük 70 μm-es hálón és PBS-sel mossuk. Az elhalt sejteket kizárták az elemzésből a Zombie NIR ™ Fixable Vability Kit használatával, a gyártó utasításainak megfelelően és az előzőekben leírtak szerint (65). A CD45 + pozitív sejteket PE-Cy ™ 5 jelzett antitest (30-F11 klón, BD Biosciences, Franklin Lakes, USA) segítségével azonosítottuk. Az elemzést FlowJo v10.0 alkalmazásával hajtottuk végre.

Sejtkultúra-tanulmányok

A primer tubuláris hámsejteket (pTEC) 3 hetes egerek veséiből izoláltuk, és 10% magzati borjúszérumot, 1% penicillin – sztreptomicint, 125 ng/ml prosztaglandin E1-t tartalmazó DMEM/F12-ben tartottuk (Calbiochem, Darmstadt, Németország). ), 25 ng/ml EGF, 1,8 μg/ml l-tiroxin, 3,38 ng/ml hidrokortizon és 2,5 mg/ml inzulin-transzferrin-nátrium-szelenit-kiegészítő (IT-SS) (mindez Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Németország) (66., 67.). Az összes sejtet inkubátorban tenyésztettük 37 ° C-on, 5% CO2-nál, és CaOx kristályokkal stimuláltuk (1-2 μm méretű; Alfa Aesar, Karlsruhe, Németország).

RNS előkészítés és valós idejű kvantitatív PCR

A teljes RNS-t a pTEC-ekből izoláltuk Qiagen RNS extrakciós készlet segítségével (Düsseldorf, Németország), a gyártó utasításainak betartásával. A mennyiségi meghatározás után az RNS minőségét agaróz gélek segítségével értékeltük. Elkülönített RNS-ből cDNS-t készítettünk reverz transzkriptáz (Superscript II; Invitrogen, Carlsbad, USA) felhasználásával. A valós idejű kvantitatív PCR-t (qPCR) SYBRGreen PCR mester keverékkel hajtottuk végre, és egy Light Cycler 480-mal (Roche, Mannheim, Németország) elemeztük. Az összes génexpressziós értéket normalizáltuk 18S rRNS alkalmazásával háztartási génként. Az amplifikációhoz használt összes primer a Metabion (Martinsried, Németország) cégtől származik, és az 1. táblázatban szerepel.

Asztal 1. A qPCR primer szekvenciái.

Immunblot

Miután meghatároztuk a fehérjekoncentrációkat a vizeletmintákban, 50 μg fehérjeoldatot összekevertünk 4x nátrium-dodecil-szulfát töltőpufferrel, és 5 percig 95 ° C-on denaturáltuk Western blot elemzés céljából. A fehérjéket ezután nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézissel elválasztottuk, és polivinilidén-difluorid membránra vittük át. A membránhoz való nem specifikus kötődést 1 órán át szobahőmérsékleten blokkoltuk 5% zsírmentes tejjel, triszpufferolt sóoldatban. A membránokat ezután egy éjszakán át 4 ° C-on inkubáltuk egy primer PTX3 antitesttel (2C3 klón, Hycult Biotechs, Plymouth Meeting, USA), majd inkubáltuk egy másodlagos nyúl anti-egér IgG HRP-vel jelölt antitesttel. Az immunfestett sávokat kemilumineszcens készlet segítségével (ECL készlet, GE Healthcare, Cardiff, Egyesült Királyság) detektáltuk. A vizeletfehérjék egyenlő terhelését Ponceau Red festéssel szemléltettük (1 óra szobahőmérsékleten). Mindkét festés intenzitását denzitometriával tovább elemeztük (J kép). A vizeletmintákból származó egér PTX3, valamint a rekombináns PTX3 pozitív kontroll a várható sávot 45 kDa körül mutatta.

Chemico-ban Kalcium-oxalát kristályok előállítása és jellemzése

Meghatározott méretű és alakú kalcium-oxalát-kristályokat állítottak elő máshol leírtak szerint (68). Röviden: 10 mM nátrium-oxalát és 1 mM kalcium-klorid oldatokat készítettünk 10 mM TRIS-HCl puffer (pH 7,3) alkalmazásával. A CaOx kristály előállításához 1 térfogat nátrium-oxalát oldatot éjszakán át inkubáltunk 4 ° C-on, 0,5 térfogatnyi PBS-sel vagy rhPTX3-mal, különböző koncentrációkban. Ezután 1 térfogat kalcium-klorid-oldatot adunk hozzá, és 24 órán át 4 ° C-on tartjuk. A különböző készítmények CaOx kristályméretét fényes fénymikroszkóppal vagy áramlási citometriával határoztuk meg.

Rekombináns humán PTX3

A humán PTX3 rekombinánsan expresszálódott egy PerC6 humán sejtvonalban. Röviden, a Per.C6 sejteket (Crucell, Leiden, Hollandia) stabilan transzfektáltuk egy plazmid vektorral (pcDNA2001Neo-hPTX3), amely a CMV promoter irányítása alatt humán PTX3 cDNS-t hordozott. A transzfekció után egy erősen termelődő klónt választottunk ki és bővítettünk a fehérje expressziójához. A rekombináns fehérjét kondicionált táptalajból tisztítottuk egy többlépcsős kromatográfiás stratégia alkalmazásával, a korábban leírtak szerint (69). A fehérje homogenitását a végtermékben analitikai méretkizárásos kromatográfiával (SEC), SDS-PAGE-val és immunblottozással (39) értékeltük. A tisztított fehérje N-kapcsolt glikozilezését PNGáz F (Sigma Aldrich) alkalmazásával vizsgáltuk, az előzőekben leírtak szerint (37).

Statisztikai analízis

Az adatok átlagként vannak feltüntetve a SEM-ben, vagy boxplot statisztikák. Minden más statisztikai elemzés előtt ellenőriztük az adatokat a normális eloszlás (Shapiro-Wilk teszt), a homoszkedaszticitás (Levene-teszt) és a kiugró értékek (Grubb-teszt) szempontjából. A normálisan elosztott és homoszedasztikus adatsorokat statisztikai szignifikáns különbségekre teszteltük ANOVA és poszt-hoc Bonferroni korrekcióját többszörös összehasonlításhoz használták. A heteroszkedasztikus adatokat a Games-Howell nyomán korrigáltuk poszt-hoc teszt. A nem normálisan elosztott adatsorokat Kruskal-Wallis és Nemenyi tesztekkel hasonlítottuk össze. Értéke o 0,05 n.s., o Kulcsszavak: vesekő, kólika, hyperoxaluria, kristályok, nephrolithiasis, urolithiasis, PTX3

Idézet: Marschner JA, Mulay SR, Steiger S, Anguiano L, Zhao Z, Boor P, Rahimi K, Inforzato A, Garlanda C, Mantovani A és Anders HJ (2018) A Long Pentraxin PTX3 a hiperoxaluria-kapcsolódó nephrocalcinosis endogén inhibitora és krónikus vesebetegség. Elülső. Immunol. 9: 2173. doi: 10.3389/fimmu.2018.02173

Beérkezett: 2018. április 30 .; Elfogadva: 2018. szeptember 03 .;
Publikálva: 2018. szeptember 25.

Uday Kishore, Brunel University London, Egyesült Királyság

Robert Braidwood Sim, Oxfordi Egyetem, Egyesült Királyság
Lubka T. Roumenina, INSERM U1138 Centre de Recherche des Cordeliers, Franciaország

† Ezek a szerzők egyformán járultak hozzá ehhez a munkához