Halolajban és leucinban gazdag étrend javítja a hiperkalcémiát a tumor által kiváltott cachecticus egerekben

Rogier L.C. Plas

1 az emberi táplálkozás és egészségügy osztálya, Wageningen Egyetem, 6700 EV Wageningen, Hollandia [email protected] (M.P.); [email protected] (J. M.); [email protected] (R.F.W.)

Mieke Lengyelország

1 az emberi táplálkozás és egészségügy osztálya, Wageningen Egyetem, 6700 EV Wageningen, Hollandia [email protected] (M.P.); [email protected] (J. M.); [email protected] (R.F.W.)

Joyce Faber

2 Danone Nutricia Research, Nutricia Advanced Medical Nutrition, 3584 CT Utrecht, Hollandia; [email protected] (J. F.); [email protected] (M.v.D.); [email protected] (A.v.H.)

Josep Argilès

3 Rákkutató Csoport, Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, Facultat de Biologia, Universitat de Barcelona, 08193 Barcelona, Spanyolország; ude.bu@seligraj

Miriam van Dijk

2 Danone Nutricia Research, Nutricia Advanced Medical Nutrition, 3584 CT Utrecht, Hollandia; [email protected] (J. F.); [email protected] (M.v.D.); [email protected] (A.v.H.)

Alessandro Laviano

4 Klinikai Orvostan Tanszék, La Sapienza Egyetem, 185 Róma, Olaszország; [email protected]

Jocelijn Meijerink

1 az emberi táplálkozás és egészségügy osztálya, Wageningen Egyetem, 6700 EV Wageningen, Hollandia [email protected] (M.P.); [email protected] (J. M.); [email protected] (R.F.W.)

Renger F. Witkamp

1 az emberi táplálkozás és egészségügy osztálya, Wageningen Egyetem, 6700 EV Wageningen, Hollandia [email protected] (M.P.); [email protected] (J. M.); [email protected] (R.F.W.)

Ardy van Helvoort

2 Danone Nutricia Research, Nutricia Advanced Medical Nutrition, 3584 CT Utrecht, Hollandia; [email protected] (J. F.); [email protected] (M.v.D.); [email protected] (A.v.H.)

5 NUTRIM Táplálkozási és Transzlációs Kutatás Metabolizmusban, Egészségügyi, Orvostudományi és Élettudományi Kar, Maastrichti Egyetem, 6229 ER Maastricht, Hollandia

Klaske van Norren

1 az emberi táplálkozás és egészségügy osztálya, Wageningen Egyetem, 6700 EV Wageningen, Hollandia [email protected] (M.P.); [email protected] (J. M.); [email protected] (R.F.W.)

Társított adatok

Absztrakt

1. Bemutatkozás

A rákkal kapcsolatos hiperkalcémia a rosszindulatú daganatokban szenvedő betegek akár 30% -ában is megfigyelhető [1]. Nagyon gyakran ez fokozott csontfelszívódással jár [2]. A kalcium létfontosságú szerepet játszik számos különböző élettani funkcióban, például az összes izomsejt-típus összehúzódásában és az idegsejtek szignálozásában. Egészséges egyénekben a kalcium plazmakoncentrációját szorosan szabályozza a mellékpajzsmirigy-hormon (PTH), a D-vitamin és a kalcitonin kölcsönhatása [2]. Rosszindulatú rendellenességekben szenvedő betegeknél a kalcium egyensúlya gyakran megszakad, amit a megnövekedett kalciumszint mutat [1]. A kalcium részben kötődik az albuminhoz, és plazmaszintjét vagy albuminnal korrigált szintként (a klinikai gyakorlatban gyakran), vagy teljes Ca 2+ -szintben (szabad + kötött) fejezik ki. A hiperkalcémiát a betegeknél enyhe a 10,5–11,9 mg/dl (2,6–2,9 mmol/l) közötti, közepes mértékű 12–13,9 mg/dl (3,0–3,4 mmol/l) és 14 mg/dkg felett súlyos. dL (3,5 mmol/l) szérum teljes Ca 2+ [1,3]. A rosszindulatú daganattal kapcsolatos hiperkalcémia fő oka a csontképződés és a reszorpció egyensúlyhiánya [3].

A hiperkalcémiával járó leggyakoribb klinikai tünetek neurológiai, pszichiátriai, gyomor-bélrendszeri, kardiovaszkuláris és veseelégtelenségekhez kapcsolódnak [2,3,4]. A neurológiai és pszichiátriai tünetek közé tartozik a fáradtság, a letargia, a mozgásszervi fájdalom, a depresszió és még a kóma is. A gyomor-bél traktus csökkent mozgása székrekedést és étvágycsökkenést okozhat. A szív- és érrendszeri tünetek közé tartoznak a szívritmuszavarok és a magas vérnyomás. Ezenkívül a veseelégtelenség gyakran jelen van hiperkalcémiában. A hiperkalcémia tüneteit gyakran észlelik a rákos betegeknél. Például myeloma multiplexben szenvedő betegeknél a szérum kalciumszint az életminőség, a fáradtság és a fizikai működés független előrejelzője volt [5].

Három javasolt mechanizmus létezik, amelyek révén a rosszindulatú daganatok befolyásolhatják az egyensúlyt a csontban a Ca beépülése és a felszívódása között [2]. Az első a csont fokozott degradációjával jár együtt az oszteoklasztok által, amelyek a csontban vagy annak közelében lévő metasztázisok vagy primer tumorok által kiválasztott tényezők által aktiválódnak. A második mechanizmus a gyulladásos mediátorok, például az interleukin 6 (IL-6), a prosztaglandin E2 (PGE-2) és a PTH-val kapcsolatos fehérje (PTHrP) megnövekedett szintjét foglalja magában, amelyek közvetlenül a csont megnövekedett lebomlását okozzák. A harmadik lehetőség az együttélő primer hiperparatireoidizmussal való kapcsolaton alapul. E három javasolt mechanizmus közül a tumor által kiválasztott PTHrP-t tartalmazó mechanizmust tartják a legkiemelkedőbbnek és felelősnek a rosszindulatú daganatokkal összefüggő hiperkalcémiás betegek 80% -ában [4].

2. Eredmények

2.1. A leucin és a halolaj hatása in vivo az A, B kísérletben

2.1.1. Kalciumszintek és összefüggésük a hasított testtel, az orgona tömegekkel és az EDL izomműködésével.

2. táblázat

2.1.2. A PGE-2 plazma és a tumor PTHrP

Beszámoltak arról, hogy a gyulladásos mediátorok, mint a PGE-2 és a PTHrP, potenciális szerepet játszhatnak a hiperkalcémia kialakulásában. A plazma PGE-2 szintje szignifikánsan megemelkedett a TB-ben a kontroll egerekhez képest, amint az a 2. B ábrán látható. Ez a növekedés csökkenthető a halolaj hozzáadásával leucinnal vagy anélkül. A plazma Ca 2+ és PGE-2 szintek szignifikánsan korreláltak (Pearson r = 0,6062 és p 2. ábra. F. A tumor PTHrP szintje szignifikánsan alacsonyabb volt azokban a TB állatokban, amelyek halolajjal és leucinnal dúsított étrendet kaptak, összehasonlítva a TB állatokkal, kiegészítés nélkül, amint azt a 2. ábra C. A tumor PTHrP szintjei nem korreláltak a plazma Ca 2+ szintjével, azonban meg kell jegyezni, hogy a kontroll állatoknál nem határoztak meg PTHrP szintet, mivel nincs tumoruk.

A leucin (LEU), a halolaj (FO), valamint a leucin és a halolaj kombinációjának hatása a plazma PGE-2-re (A); korreláció a plazma PGE-2 és a plazma Ca2 + szintek között (Pearson r = 0,6062, p 3. ábra A, B. A leucinnak nincs hatása a PTHrP termelésére in vitro, amint az a 3. ábrán látható. Egyik komponens sem volt hatással az életképességre vagy a toxicitásra ábrán látható tesztelt koncentrációkban. Tekintettel arra, hogy a DHA és az EPA bizonyult a leghatékonyabbnak a PTHrP csökkentésében, ezeket beépítettük a következő kísérletekbe. A megállapítások konzisztenciájának tesztelése és a hatásos komponensek hatásainak utánzása céljából A DHA és az EPA a tumoron a D kísérletben teszteltük a nagyobb összefolyású sejtekre gyakorolt hatást. Az EPA hatása már nem volt jelen, a DHA hatása azonban ezekben az összefolyó sejtekben reprodukálható volt 32% -os és 34% -os redukcióval. % 50 μM DHA-nál, illetve 100 μM DHA mellett, ahogy a 3. D, E ábra mutatja.

A C26 sejtek DHA-val történő kiegészítésének hatása (A); és CXB (B) PGE-2 szinteken; és a CXB kiegészítésének hatása (C) PTHrP szinteken. Az adatok az átlag ± SEM értéket képviselik. A *, ** és *** szignifikáns különbségeket mutatnak a vivőanyag-kontrollhoz képest (ill. p 5 sejt 0,2 ml-ben) szubkután oltottuk be az egerek jobb oldali lágyékába. A kontroll (C) állatok ál-injekciót kaptak 0,2 ml HBSS-sel. Az állatokat lemértük és altattuk (izoflurán/N2O/O2) a tumor beoltását követő 20. napon. A vázizmokat és a belső szerveket boncoltuk és lemértük. A tetem tömegét úgy számoltuk ki, hogy a daganat tömegét kivontuk a test tömegéből. Az ex vivo EDL izomfunkciókat különböző frekvenciákon mértük 20 és 167 Hz között. A tetanuszt ≥83 Hz frekvencián érték el.

3.1.3. A PGE-2 plazma és a tumor PTHrP az A kísérletben

Az A kísérletből származó állatoknál a plazma PGE-2-t kereskedelmi forgalomban lévő anti-PGE-2 nyúl poliklonális antitest alapú közvetlen enzim immunvizsgálattal (Oxford Biomedical Research, Oxford, MI, USA) használtuk a gyártó protokollja szerint. Az A kísérletben az állatok daganatának PTHrP-szintjét kvantitatív PTHrP enzimhez kapcsolt immunszorbens (ELISA) vizsgálati készlet (USCN Life Science Inc., Wuhan, Hubei, Kína) segítségével mértük a gyártó protokollja szerint. A PTHrP szinteket a fehérje milligrammjára jutó mennyiségben fejeztük ki, amelyet Pierce TM BCA fehérjekészlettel (Thermo Fisher Scientific, Rockford, Illinois, USA) határoztak meg. Sajnos a tárolt plazmaanyag mennyisége nem volt elegendő a plazma PTHrP szintjének meghatározásához.

3.1.4. Plazma kalcium az A, B kísérletben

Annak megvizsgálására, hogy a kalciumszint emelkedése összefüggött-e a test és a szerv tömegével és a PGE-2 szinttel, a plazma teljes Ca 2+ szintjét (szabad kalcium + albuminhoz kötött kalcium) kalorimetriásan határoztuk meg a Reinier de Graaf Klinikai Kémiai Laboratóriumi Kórházban (Delft)., Hollandia).

3.2. In vitro kísérletek

A lehetséges mögöttes mechanizmusok meghatározásához egy sor in vitro kísérletet állítottunk fel. Először kipróbáltuk az egér vizsgálatokban alkalmazott étrendben lévő fő komponenseket alacsony daganatos sejteknél, amint azt a C. kísérletben láthattuk. Kontrollként életképességi és toxicitási vizsgálatokat végeztünk a komponensek potenciálisan toxikus hatásainak kizárására a tesztelt koncentrációk. Ezt követően a leghatékonyabb vegyületekkel folytattuk nagyobb számú sejten, amint azt a D kísérletben láttuk, hogy teszteljük hatékonyságukat olyan helyzetekben, amelyek jobban hasonlítanak az in vivo helyzetre (vagyis a tumor nagyon sok sejtből áll). Végül megvizsgáltuk a leghatékonyabb vegyület lehetséges hatásmechanizmusát, ahogyan azt az E kísérlet is mutatja, felmérve a COX-2 lehetséges érintettségét egy specifikus COX-2 inhibitor alkalmazásával. A D, E kísérletben csak toxicitási vizsgálatokat végeztek.

3.2.1. Az egér C26 sejtjeinek tenyésztése

Minden in vitro kísérletet egér C26 tumorsejtekkel (American Type Culture Collection; ATCC, Teddington, Egyesült Királyság) használtunk. A sejteket DMEM-ben tenyésztettük 10% hő-inaktivált szarvasmarha-magzati szérummal 37 ° C-on, 5% CO2-os, nedvesített levegő atmoszférában. A C, D, E kísérlet kiegészítéséhez a sejteket egy 24 üreges lemezre oltottuk. A C kísérlethez 25 000 sejtet oltottunk be, ami 24 óra elteltével 10–20% -os összefolyáshoz vezetett, bőséges sejt-sejt érintkezés mellett. A D, E kísérlethez 250 000 sejtet oltottunk be, ami 24 óra elteltével 80–90% -os összefolyáshoz vezetett, magas fokú sejt-sejt érintkezéssel.

3.2.2. PTHrP és PGE-2 termelés a C26 sejtek DHA-val, EPA-val, leucinnal és CXB-vel történő kiegészítésével

24 órás inkubálás után az egyes mélyedésekből a táptalajt eltávolítottuk, és a C26 sejteket tesztvegyülettel vagy vivőanyag-kontrollal egészítettük ki. A kiegészítést 24 órán keresztül a dokozahexaénsav (DHA, 22: 6n-3; Sigma-Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf, Németország), eikozapentaénsav (EPA, 20: 5n-3; Sigma-Aldrich) különböző koncentrációival hajtottuk végre. Chemie GmbH), leucin (Sigma-Aldrich Chemie GmbH) vagy celekoxib (CXB, Sigma-Aldrich Chemie GmbH). Etanolt használtunk oldószerként az ω-3 PUFA-khoz (DHA és EPA), a DMSO-t oldószerként a CXB-hez, a leucint pedig PBS-ben oldottuk. Minden esetben a végső etanol/DMSO koncentráció soha nem haladta meg a 0,1 térfogat% -ot. Az összes kísérletet legalább háromszor hajtottuk végre, és mindegyik körülményt két vagy három példányban hajtottuk végre. 24 órás kiegészítés után a felülúszót eltávolítottuk a PTHrP és a PGE-2 elemzéséhez. A C26-sejtes felülúszó PTHrP-termelését a kereskedelemben kapható ELISA (USCN Life Science Inc., Wuhan, Hubei, Kína) alkalmazásával mértük a gyártó protokollja szerint. A PGE-2 termelést egy kereskedelemben kapható monoklonális ELISA kit alkalmazásával mértük (Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan, USA).

3.2.3. Életképesség és citotoxicitás

A C kísérlet esetében a sejtek életképességét a sejtproliferáció (XTT) Kit II-vel (Roche, Basel, Svájc) mértük, a gyártó protokollja szerint. A 24 üregű lemezre beoltott sejteket 30-90 percig inkubáltuk az XTT reagenskeverékkel. Inkubálás után 100 ul felülúszót vittünk egy 96 lyukú lemezre, és az abszorbanciát 450 nm-en mértük ELISA lemezolvasó alkalmazásával. Negatív kontrollként a sejteket Triton X100-mal kezeltük, ami teljes sejtlízist eredményezett.

A citotoxicitást minden kísérletnél a citotoxicitás detektálásának (LDH) készletével (Roche, Bázel, Svájc) mértük, a gyártó protokollja szerint. Ez a készlet a felülúszóban jelenlévő relatív LDH-tartalmat méri, amely tükrözi a citotoxicitást. A 24 üreges lemezre beoltott sejtek felülúszóját egy 96 üreges lemezre vittük, és az LDH-tartalom mérésére használtuk. Az abszorbanciát 492 nm-en mértük ELISA lemezolvasóval. Pozitív kontrollként a sejteket Triton X100-mal inkubáltuk, ami teljes sejtlízist eredményezett. Az életképesség és a citotoxicitás eredményeit az S1 és S2 ábrák mutatják be.

3.3. Statisztika

Minden adatot átlag ± SEM-ben fejezünk ki. A statisztikai elemzéseket a GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc., La Jolla, Kalifornia, USA) segítségével végeztük. Az A kísérletben különböző tételeket használtunk fel. Ezért minden paraméter esetében meghatározták, hogy az adatok kombinálása megengedett, vagyis nem volt interakció a csoportok és a kísérletek között. Az összes in vivo kísérlet esetében az összehasonlításokat varianciaanalízissel (ANOVA) és Dunnett-féle többszörös összehasonlító teszttel végeztük a daganatot hordozó csoporttal táplálékkiegészítők nélkül, referenciaként. A különbségeket szignifikánsnak ítélték p-érték 2+ esetén, amelyek negatívan korreláltak a hasított test tömegével és számos szervtömeggel. Ezenkívül a Ca 2+ szint pozitívan korrelált a plazma PGE-2 szinttel. Ezenkívül a táplálkozási kombináció csökkentette a megnövekedett plazma PGE-2 és PTHrP szintet a tumorszövetben.

Az irodalomban csak néhány tanulmányról számoltak be a halolaj, vagy annak fő alkotóelemei, az EPA és a DHA, valamint a tumorral összefüggő hiperkalcémia kapcsolatáról. Egy 1984-es vizsgálatban a prosztaglandint termelő, HSDM1 fibrosarcomát viselő egerek menhaden halolajat kaptak magas EPA-tartalommal (EPA: DHA arány 2,4: 1). Ez a beavatkozás csökkentette a plazma Ca 2+ szintjét a daganatot hordozó egerekben [16]. Mivel a hiperkalcémia összefügg a csont ásványi sűrűségével, és a csont ásványi sűrűségének csökkentése a C26 modell jól ismert jellemzője, a halolaj kezelés és a csont ásványianyag sűrűség közötti összefüggésekről szóló irodalmat is megvizsgáltuk. Az ω3 zsírsavak és az oszteoporózis szisztematikus áttekintése azonban arra a következtetésre jutott, hogy a kevés tanulmány és a szerény mintanagyság miatt nehéz egyértelmű következtetéseket levonni [17]. Az emlőrákot túlélőkben az EPA és a DHA nagy dózisai csökkentették a csontreszorpciót [18]. Sőt, a halolajról kiderült, hogy megakadályozza az emlőrák sejtjeinek metasztázisát a csontokban és az oszteolitikus elváltozásokban az emberi egér xenograft modelljében [19].

Vizsgálatunkban a Ca 2+ szint csökkenését csak a leucin és a halolaj kombinálásakor figyelték meg. Érdekes módon ez azt sugallja, hogy a leucinnak további kedvező hatása lehet, de csak halolaj jelenlétében. A leucinról beszámoltak arról, hogy befolyásolja a szövetek inzulinérzékenységét és fokozza az inzulin felszabadulását [20]. Ezenkívül úgy tűnik, hogy az inzulin antifoszfatikus hatású [21]. Beszámoltak arról, hogy a PTH in vivo beadása a foszfát tubuláris visszaszívódásának csökkenését okozta, amelyet megfordított egy euglikémiás hiperinsulinémia fiziológiai tartományon belüli egymásra helyezése [21]. A leucin hiperkalcémiára gyakorolt hatása tehát az inzulin felszabadulásának fokozásával magyarázható, ami a foszfát fokozott vesefelszívódásához vezet.

A hasított test és a kalciumszint, valamint az izomtömeg és a kalcium közötti negatív összefüggés azt jelzi, hogy modellünkben a cachexia és a hypercalcaemia összefüggésbe hozható. Nehéz azonban megjelölni, hogy milyen mértékben kapcsolódnak egymáshoz. Az izom működését tekintve azonban korrigálható az izomtömeg. Magas inverz összefüggést tártunk fel az izomműködés és a hiperkalcémia között a maximális erő, az összehúzódási sebesség és a relaxációs sebesség szempontjából. Ez az összefüggés az izomtömeg korrekciója után is megmaradt, bár alacsonyabb R értékekkel, ami azt jelzi, hogy a kalciumszint és az izomműködés elvesztése közötti összefüggésben a cachexia szindróma részeként tömegfüggetlen vegyület van.

Korábbi tanulmányok arról számoltak be, hogy a C26 modell hiperkalcémiáját az IL-6 és a PTHrP közvetíti [31]. Tudomásul vesszük ennek a vizsgálatnak a korlátait, mivel nem voltunk képesek sem a PTHrP-t, sem az IL-6-ot mérni a plazmában. Az irodalomból tudjuk, hogy ugyanaz az SNC képes csökkenteni az IL-6 plazma szintjét a C26 modellben [24]. Sőt, eredményeink azt mutatták, hogy a halolaj és a leucin táplálkozási kombinációja csökkentette a tumor PTHrP szintjét. Úgy gondolják, hogy a PTHrP emelkedése rosszindulatú daganatban a COX-2 aktivitás növekedésével jár [8]. Ezért a Ca 2+ szint erős pozitív korrelációja a fő COX-2 által közvetített gyulladásos mediátorral, a PGE-2-vel arra utalhat, hogy a PTHrP is részt vesz a hiperkalcémia kiváltásában. Ennek a hipotézisnek a teszteléséhez in vitro kísérleteket hajtottunk végre.

A csontok egészsége és a kalcium homeosztázis fontos tényező, amelyet a rosszindulatú daganat befolyásol. Ebben a tanulmányban kimutattuk, hogy a tumor által kiváltott hiperkalcémia erősen korrelál számos kachexiával kapcsolatos kimenetellel. Kimutattuk azt is, hogy a magas leucin- és halolaj-táplálkozási beavatkozás csökkentheti a tumor káros hatásait a kalcium homeosztázisra egy daganatot hordozó C26 egérmodellben. Ez klinikailag releváns, mivel a kalcium homeosztázis nagy hatással lehet a betegek mindennapi életére. 686 myeloma multiplexes beteg vizsgálatában a szérum kalciumszint az életminőség (QOL) pontszámokkal, étvágytalansággal, émelygéssel/hányással, fizikai működéssel függött össze (p (356K, pdf)