Fokozott vese-felhalmozódás a sótartalmú hipertóniás patkányok hipertóniás nephropathiájában

Yoshiro Naito

1 Szív- és érrendszeri osztály, Belgyógyászati Klinika, Hyogo College of Medicine, Nishinomiya, Japán,

Hisashi Sawada

1 Szív- és érrendszeri osztály, Belgyógyászati Klinika, Hyogo College of Medicine, Nishinomiya, Japán,

Makiko Oboshi

1 Szív- és érrendszeri osztály, Belgyógyászati Klinika, Hyogo College of Medicine, Nishinomiya, Japán,

Aya Fujii

1 Szív- és érrendszeri osztály, Belgyógyászati Klinika, Hyogo College of Medicine, Nishinomiya, Japán,

Shinichi Hirotani

1 Szív- és érrendszeri osztály, Belgyógyászati Klinika, Hyogo College of Medicine, Nishinomiya, Japán,

Toshihiro Iwasaku

1 Szív- és érrendszeri osztály, Belgyógyászati Klinika, Hyogo College of Medicine, Nishinomiya, Japán,

Yoshitaka Okuhara

1 Szív- és érrendszeri osztály, Belgyógyászati Klinika, Hyogo College of Medicine, Nishinomiya, Japán,

Akiyo Eguchi

1 Kardiovaszkuláris osztály, Belgyógyászati Klinika, Hyogo Orvostudományi Főiskola, Nishinomiya, Japán,

Daisuke Morisawa

1 Szív- és érrendszeri osztály, Belgyógyászati Klinika, Hyogo College of Medicine, Nishinomiya, Japán,

Mitsumasa Ohyanagi

2 A koszorúér-betegség osztálya, Belogo Osztály, Hyogo Orvostudományi Főiskola, Nishinomiya, Japán,

Takeshi Tsujino

3 Gyógyszerészeti Tanszék, Hyogo Egészségtudományi Egyetem, Kobe, Japán,

Tohru Masuyama

1 Szív- és érrendszeri osztály, Belgyógyászati Klinika, Hyogo College of Medicine, Nishinomiya, Japán,

A kísérletek megtervezése és megtervezése: YN TM. Végezte a kísérleteket: YN TM HS MO AF SH SH YO YO AE DM MO TT. Elemezte az adatokat: YN HS TM. Hozzájáruló reagensek/anyagok/elemző eszközök: YN TM. Írtam a papírt: YN TM.

Absztrakt

Bevezetés

A krónikus vesebetegségben (CKD) szenvedő betegek száma növekszik, és a CKD a hirtelen halál fokozott kockázatával jár [1]. Eközben a magas vérnyomás fontos kockázati tényező a CKD progressziójában [2]. Mivel az esszenciális hipertóniával társuló CKD-re általában hipertóniás nephropathiát alkalmaznak, érdemes megvizsgálni a hipertóniás nephropathia patofiziológiáját.

A vas az élet szükséges eleme, és számos anyagcsere-folyamatban nélkülözhetetlen szerepet játszik. Ennek ellenére a felesleges vasfelhalmozódás felgyorsítja a Fenton reakciót, ami oxidatív stresszhez és sejtkárosodáshoz vezet. Érdekes módon rendellenes vaslerakódás figyelhető meg az emberi krónikus vesebetegség tubulusaiban [3] és a nephropathia állatmodelljeiben [4] - [6]. Ezenkívül a közelmúltban beszámoltunk arról, hogy a vese vese felhalmozódása és az intracelluláris vastranszportfehérjék, például az 1. transzferrin receptor (TfR1) és a kétértékű fém transzporter 1 (DMT-1) expressziója megnövekszik a jól bevált 5/A CKD 6 nephrectomia patkány modellje. Megmutattuk továbbá, hogy az étrendi vaskorlátozás gyengíti a vesekárosodás kialakulását CKD modell patkányokban [7]. Azonban nagyrészt nem ismert, hogy a vas és az intracelluláris vas-transzportfehérjék részt vesznek-e a hipertóniás nephropathia patofiziológiájában. Ezenkívül a vas korlátozásának a só által kiváltott nephrosclerosis kialakulására gyakorolt hatása ismeretlen.

Jelen tanulmányban azt vizsgáljuk, hogy a vas részt vesz-e a hipertóniás nephropathia kialakulásában és a vas korlátozásának a nephrosclerosisra gyakorolt hatását sótartalmú, stroke-ra hajlamos spontán hipertóniás patkányokban (SHRSP). Megállapítottuk, hogy a sóval megterhelt SHRSP veséiben masszív vasfelhalmozódás és megnövekedett vastartalom figyelhető meg, és hogy a vas korlátozása gyengíti a magas vérnyomású nephropathia kialakulását a sótartalmú SHRSP-ben.

Anyagok és metódusok

Etikai nyilatkozat

Valamennyi kísérleti eljárásunkat a Hyogo College of Medicine Állatkutatási Bizottsága hagyta jóvá (protokollszám: 13-036), és azokat a Japán Laboratóriumi Állattudományi Szövetség által kiadott Állatkísérleti Irányelveknek megfelelően hajtották végre.

Állati modellek

A vérnyomás, a vizelet, a vér és a vese vastartalmának értékelése

Az SBP-t nem invazív számítógépes farok-mandzsetta rendszerrel (MK-2000, Muromachi Kikai) mértük [8]. A vizeletben az összes fehérje és a vas koncentrációját pirogallol vörös módszerrel, illetve atomabszorpciós módszerrel határoztuk meg [7]. A vizelet-8-hidroxi-2′-deoxi-guanozin (8-OHdG) szintjét enzimhez kapcsolt immunszorbens teszttel (Japan Institute for the Control of Aging) értékeltük. A perifériás vérsejtek számát, a szérum BUN, a szérum kreatinin és a szérum vasszintjét a korábban beszámoltak szerint határozták meg [8]. A vese vastartalmát atomabszorpcióval határoztuk meg [9].

RNS extrakció és valós idejű kvantitatív RT-PCR

A teljes RNS-t a veséből és a májból TRIzol-reagens (Invitrogen) alkalmazásával extraháltuk a gyártó utasításainak megfelelően. A teljes RNS-t DNázzal kezeltük, és reverz átírással cDNS-be véletlenszerű primerek (Applied Biosystems) alkalmazásával. Valós idejű PCR reakciókat az ABI PRISM 7900 alkalmazásával hajtottunk végre TaqMan Universal PCR Master Mix és TaqMan gén expressziós tesztekkel (Applied Biosystems) [9]. Az mRNS szinteket normalizáltuk a GAPDH génexpresszióhoz. TaqMan gén expressziós vizsgálatokat használtunk próbaként és primerekként az egyes génekhez az alábbiak szerint: hem-oxigenáz-1 (HO-1) (assay ID Rn01536933_m1), hepcidin (assay ID Rn00584987_m1), III típusú kollagén (assay ID no Rn01437683_m1), transzformálás növekedési faktor-β (TGF-β) (assay ID Rn99999016_m1), CD68 (assay ID Rn01495634_g1), 1-es típusú plazminogén aktivátor inhibitor (PAI-1) (assay ID Rn01481341_m1) és glicerinaldehid-3-foszfát-hidrogenáz (GAPDH) Rn99999916_m1).

Hisztomorfometrikus elemzés

A veseszöveteket pufferolt 4% paraformaldehiddel rögzítettük, paraffinba ágyazva, és 4 um vastag szakaszokra vágtuk. Periodikus sav-Schiff és Masson trichrom festését soros szakaszok alkalmazásával végeztük. Vasvas lerakódásokat berlin kék festéssel festettek. A glomeruláris elváltozásokat és a tubuláris elváltozásokat szemikvantitatív pontszámmal értékeltük a korábban leírt módszerrel [10].

Immunhisztokémiai elemzés

A vese metszeteket immunhisztokémiailag festettük primer egér anti-CD68 antitesttel (AbD Serotec; hígítás 1-1000), elsődleges egér anti-desmin antitesttel (Dako; hígítás 1-50), elsődleges egér anti-TfR1 antitesttel (Zymed Laboratories; 1–200 hígítás), primer nyúl anti-DMT-1, vashatásra érzékeny elem antitesttel (Alpha Diagnostic; hígítás 1∶100), és egy primer nyúl antihepcidin-25 antitest (abcam; hígítás 1000 ×). Az immunfoltokat avidin-biotin-peroxidáz konjugátum és 3,3′-diaminobenzidin szubsztrát alkalmazásával tettük láthatóvá. Minden szakaszt hematoxilinnal festettek. A CD68 pozitív sejtek mennyiségi meghatározását és a desmin festést a korábban leírtak szerint értékeltük [7]. A terminális dezoxinukleotidil-transzferáz-közvetített dUTP nick-end label (TUNEL) festést a gyártó utasításai szerint (In situ apoptózis detektáló készlet; TaKaRa) végeztük. A szakaszt ellenfestették a DAPI-val. A TUNEL-pozitív sejtek számát az előzőekben leírtak szerint számoltuk meg [7]. A veseszövetek egy részét gyorsan beépítették a Tissue-Tek OCT vegyületbe (Sakura Finetechnical Co), és folyékony nitrogénben lefagyasztották. A szuperoxid-kimutatást a korábban leírtak szerint végeztük [7].

Transzmissziós elektronmikroszkópia

Az elektronmikroszkópos elemzéshez a friss veseszöveteket jéghideg pufferrel rögzítettük, amely 4% paraformaldehidet, 5% glutáraldehidet és 0,2 M foszfátpuffert (pH 7,4) tartalmazott. A szöveteket a korábban leírtak szerint vizualizáltuk [7].

Statisztikai analízis

Az értékeket átlagként ± SEM jelentik. A statisztikai elemzést egyirányú varianciaanalízissel végeztük. A varianciaanalízist (Kruskal-Wallis teszt, majd Mann-Whitney U teszt) használtuk a statisztikai összehasonlításhoz. A túlélési arány értékeléséhez Kaplan-Meier-analízist használtak. Úgy ítéltük meg, hogy a különbségek szignifikánsak voltak, amikor a valószínűség értéke 1A. Ábra). Ezenkívül a DHE festés fokozott szuperoxid termelést mutatott a HS csoport veséjében (1A. Ábra). Ezenkívül az immunhisztokémiai elemzés kimutatta, hogy a TfR1 és a DMT-1 erősen expresszálódott mind a HS, mind a HS + IR csoport tubulusaiban (1A. Ábra). A hepcidin-vas-szabályozó hormon aktív formája, a hepcidin-25, gyengén expresszálódott ezeknek a csoportoknak a tubulusaiban, és a hepcidin-25 pozitív sejtek növekedése általában a HS csoportban történt, összehasonlítva a többi csoporttal (1A. Ábra). Ezután ezekben a csoportokban megvizsgáltuk a vese vastartalmát és a vizelettel történő vasürülést. Érdekesség, hogy a vese vaskoncentrációja és a vizelettel történő vaskiválasztás jelentősen megnőtt a HS csoportban a többi csoporthoz képest (1B, C ábra). Ezenkívül a vese HO-1 gén expressziója és a vizelet 8-OHdG kiválasztása szignifikánsan megnőtt a HS csoportban, míg ezek a növekedések elnyomódtak a HS + IR csoportban (1D, E ábra). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a vaszal kapcsolatos oxidatív károsodás összefüggésbe hozható a sóterhelt SHRSP-ben a hipertóniás nephropathia patofiziológiájával.

(A) A veseszelvények berlin kék, DHE, TfR1, DMT-1 és hepcidin-25 festésének reprezentatív képei. Mérlegsorok: 50 µm. (B) vese vaskoncentráció, (C) vizelettel történő vas kiválasztás, (D) vese HO-1 génexpresszió és (E) vizelet 8-OHdG kiválasztódás a kontrollban (fehér sáv), a HS (fekete sáv) és a HS + IR (szürke sáv) csoportok (n = 4–6 minden csoportban). DHE, dihidroetídium; TfR1, transzferrin receptor 1; DMT-1, kétértékű fém transzporter 1; HO-1, hem-oxigenáz-1. Kontroll, SHRSP normál étrendet táplált; HS, SHRSP magas sótartalmú étrendet táplált; A HS + IR, az SHRSP magas sótartalmú, korlátozott vastartalmú étrendet adott. * p † p 2A. ábra), jelezve, hogy a vas-korlátozás HS-étrend jelenlétében gátolta az SBP növekedését. Ezenkívül a HS-diéta szignifikánsan megnövelte a proteinuriát, a szérum BUN-szintet és a szérum kreatinin-szintet, míg ezek a lépések a HS + IR csoportban gyengültek (2B – E ábra). Másrészt a testtömeg csökkent a HS csoportban a többi csoporthoz képest. A vér hemoglobinja, az átlagos corpuscularis térfogat, az átlagos corpuscularis hemoglobin, a szérum vasszintje és a máj hepcidin gén expressziója csökkent volt a HS + IR csoportban (1. táblázat), ami azt jelzi, hogy a máj hepcidin gén expressziója a vas vashiányra adott válaszként lefelé szabályozott. HS + IR csoport. A kísérleti időszak alatt néhány patkány hirtelen stroke-ban halt meg (33%) a HS csoportban, és néhány patkányt eutanizáltak, mert görcsrohamot, a hátsó végtag bénulását és csökkent aktivitást (25%) mutattak a HS csoportban; azonban a HS + IR csoportban egyik patkány sem pusztult el. A Kaplan-Meier-elemzés azt mutatta, hogy a HS + IR csoport prognózisa jobb volt, mint a HS csoporté (2F. Ábra).