Az ITCH hiány megvédi az étrend okozta elhízástól

Absztrakt

Bevezetés

Kutatási tervezés és módszerek

Egérmodell és anyagcsere-elemzés

A C57/BL10 hátterű viszkető -/- egereket korábban leírták (10–12). A viszkető -/- egereket és a vad típusú (WT) alomtársakat 12 órás világos és sötét ciklusokban tartottuk ellenőrzött környezeti feltételek mellett, szabad hozzáféréssel a vízhez és az élelemhez. A vizsgálatokat csak hím egereken végezték. Az állatkísérleteket a Tor Vergata Egyetem Állattenyésztési és Felhasználási Bizottsága hagyta jóvá. Az étrend által kiváltott elhízási modell esetében a 6–8 hetes egereket magas zsírtartalmú étrenddel (HFD) (a kalóriák 60% -a zsírból; Research Diets, New Brunswick, NJ) vagy normál étrendben (ND) etették (standard chow 10% kalóriát zsírból; GLP Mucedola Srl, Settimo Milanese, Olaszország) 12 hétig az elválasztás után, a jelzések szerint. A metabolikus tesztelési eljárásokat korábban leírták (14,15). Az összes koleszterin, HDL, trigliceridek, aszpartát-aminotranszferáz (AST) és alanin-aminotranszferáz (ALT) szintjét a Keylab (BPC Biosed s.r.l., Róma, Olaszország) alkalmazásával mértük. A szöveteket az éhezés vagy a hűtés állapotában gyűjtöttük össze, a jelzések szerint. Az éhomi kísérletek során az állatokat 16 órán át éheztettük. Az újratáplálási kísérletek során az ételt 16 órás éhgyomorra visszahelyeztük, és az állatokat az etetés után 6 órával leöltük a szövetek izolálása céljából. A közvetett kalorimetriát a korábban leírt módon hajtották végre (16).

A rágcsáló peritoneális makrofágjainak izolálása

A peritoneális makrofágokat WT és Itch -/- egerekből izoláltuk, és a korábban leírtak szerint jellemeztük (17). Röviden, makrofágokat gyűjtöttünk olyan egerektől, amelyekhez korábban 3 napig 1 ml 3% -os tioglikolát táptalajt (Sigma-Aldrich) injektáltunk, majd a hashártya üregét átmostuk 10 ml hideg PBS-sel. A peritoneális sejteket hideg PBS-sel mostuk, 10 percig 1000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk, és megszámoltuk. A makrofág-tisztításhoz a sejteket 37 ° C-on inkubáltuk Dulbecco módosított Eagle táptalajában/F12-10 táptalajban. Az RNS-t kivontuk csatolt sejtekből, és gén expressziós elemzésre használtuk. A fluoreszcencia-aktivált sejtek szortírozójának (FACS) elemzéséhez a peritoneális sejteket centrifugáltuk, újraszuszpendáltuk Hanks kiegyensúlyozott sóoldatában, és az alábbiakban leírtak szerint tovább dolgoztuk fel.

Az adipociták és a stromalis vaszkuláris frakció izolálása

Az adipocita és a stromális vaszkuláris frakciókat (SVF) izoláltuk a WT és az Itch -/- fehér zsírszövetből (WAT) 12 hetes HFD után, a korábban leírtak szerint (16). Az RNS-t izoláltuk adipocitákból és SVF-ből, és valós idejű PCR-rel elemeztük. Az izolált frakciók tisztaságának tesztelésére az adiponektin mRNS expressziójának profilját használtuk.

Gén expressziós elemzés

A teljes RNS-t Trizol reagensek (Invitrogen Corp., Eugene, OR) alkalmazásával izoláltuk zsírszövetekből, májból, peritoneális makrofágokból, csontvelőből származó makrofágokból, RAW 264,7 sejtekből és 3T3 F44 sejtekből. A teljes RNS-t (2 ng) reverz átírással cDNS-be írtuk át a High Capacity cDNS Archive kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) segítségével. Kvantitatív valós idejű PCR-t hajtottunk végre, és az eredményeket elemeztük a korábban leírtak szerint (16).

Western Blot

Western-blotokat a korábban leírtak szerint hajtottunk végre (18). A következő antitesteket használtuk: foszfo-Insr Tyr 972, összes Insr, foszfo-Ser 473 Akt, összes Akt (sejtjelzési technológia), humán ITCH/AIP4 (Abcam) és egér ITCH (BD Pharmigen).

Szövettani elemzés

Epididymális WAT-ot, interscapularis barna zsírszövetet (BAT), máj- és bélszöveteket kaptunk egerekből, akiket HFD-vel etettek 12 hétig; a mintákat 10% paraformaldehidben rögzítettük és paraffinba ágyazottuk. Ezután tíz mikrométeres egymást követő metszeteket helyezünk a tárgylemezekre és hematoxilin-eozinnal (H-E) festjük. Olajvörös O festést végeztünk krioprezervált biopsziák májszakaszain. A fényképfelvételeket Eclipse TE 2000-S (Nikon) mikroszkóppal rögzítettük × 10 és × 20 nagyítással. A zsírsejtek méretét ugyanabban a mikroszkópban mértük × 10-es nagyítással, 5 μm-es skálán egységenként. 50 sejt átmérőjét két véletlenszerű mikroszkópos mezőben határoztuk meg Lucia G 4.61-es verzióval (64-es build), minden egér szoftverével. A nem alkoholos zsírmájbetegség súlyossága a zsír mennyiségén és típusán (makrovezikuláris és mikrovezikuláris), a gyulladás mértékén, a sejtdegeneráció jelenlétén (acidofil testek, léggömbök és Mallory hialinja) vagy nekrózison és a fibrózis mértékén alapult.

Áramlási citometriás elemzés

A máj FACS elemzését a korábban leírtak szerint végeztük (19). Röviden, a májat Collagenase 4-gyel (Sigma-Aldrich) emésztettük. Ezután a mintákat FICOLL sűrűségi gradiensnek vetettük alá (LSM-1077; Sigma-Aldrich), és CD45-APC-vel (BD Pharmigen), CD11b-FITC-vel (Miltenyi Biotec) és F4/80-PE-vel (Miltenyi Biotec) festettük. A peritoneális üregből gyűjtött sejteket CD11b-FITC (Miltenyi Biotec) és F4/80-PE (Miltenyi Biotec) felületi antigénekre festettük. A mintákat egy FACScalibur (BD biológiai tudomány) segítségével elemeztük, amely BD Cellquest Pro-t futtatott, és Flow JO-val (TreeStar, Ashland OR) elemeztük. A makrofágok meghatározása CD45 + CD11b + F4/80 volt + .

Koleszterin és trigliceridek vizsgálata

A koleszterint és a triglicerideket kivontuk a májszövetekből, és a gyártó utasításainak megfelelően a Total Cholesterol Assay kit és a Triglyceride Quantification Kit (Cell Biolabs) alkalmazásával elemeztük.

Emberi zsírszövet génexpressziós vizsgálatok

Ötven zsigeri zsírszövetmintát tanulmányoztunk egy 20 és 58 kg/m 2 közötti BMI-s kaukázusi alanyok csoportjából, akiket az Universitari Kórház Endokrinológiai Szolgálatánál vettek fel. Dr. Josep Trueta (Girona, Spanyolország). Valamennyi alany megvizsgálta, hogy testtömegük legalább 3 hónapig stabil volt-e. Az elhízáson kívül más szisztémás betegségük nem volt, és a vizsgálat előtti előző hónapban valamennyien fertőzésektől mentesek voltak. A májbetegségeket és a pajzsmirigy diszfunkciókat kifejezetten kizárták biokémiai munkával. Minden alany írásos tájékozott beleegyezést adott, miután elmagyarázták nekik a vizsgálat célját, jellegét és lehetséges kockázatait. A kórházi etikai bizottság jóváhagyta a jegyzőkönyvet. A zsírszövet mintákat választott műtéti eljárások (kolecisztektómia, hasi sérv műtét és gyomor bypass műtét) során nyerték, megmosták, széttöredezték és azonnal felvillanták folyékony nitrogénben, mielőtt -80 ° C-on tárolták és elemzésre használták.

Immunhisztokémia

A formalinban rögzített paraffinba ágyazott zsírszövet öt mikrométeres szakaszait deparaffinizáltuk és rehidratáltuk az antigén leplezése előtt. A metszeteket anti-ITCH/AIP4 (Abcam), anti-CD68 (Santa Cruz Biotechnology) és anti-CD3 (Thermo Scientific, Fremont, CA) inkubálásával inkubáltuk. A metszeteket hematoxilinnal ellenfestettük és Nikon Eclipse 90i mikroszkóp alatt vizsgáltuk. Negatív kontrollként az eljárást primer antitest hiányában hajtották végre.

Statisztikai elemzések

A kísérleti vizsgálatok eredményei átlag ± SD. A statisztikai elemzéseket egyirányú ANOVA vagy párosítatlan Student t teszt alkalmazásával hajtottuk végre, a jelzések szerint. A lineáris korreláció elemzését Spearman teszt alkalmazásával végeztük. A P -/- egerek értékei

6 hetes korukban a standard chow-val etetett Itch -/- egerek alacsonyabb testsúlyt és alacsonyabb éhomi vércukorszintet mutattak az azonos korú WT alomtársakkal összehasonlítva (1A. És B. Ábra). Ezek a különbségek általában eltűntek az öregedéssel az egerekkel, amelyeket standard chow-val etettek. Az Itch -/- egerek a limfociták Th2 polarizációját mutatják az IL-4 és az IL-13 magas expressziója miatt (12). Annak eldöntésére, hogy a Th2 limfociták növekedése eredményezi-e az M2 makrofág polarizáció növekedését, megvizsgáltuk a WT és Itch -/- egerekből származó peritonealis makrofágok M1 és M2 markereinek génexpresszióját a tioglikollát húsleves stimulációja után. A WT és az Itch -/- egerekből származó peritoneális váladékok az izolált CD11b + F4/80 + sejtek hasonló szintjét mutatták ki (Kiegészítő 1A. Ábra). Az Itch -/- makrofágok azonban szignifikáns növekedést mutattak az Mgl2, Arg1 és Ym1 M2 markerek expressziójában. Az M1 markerek kifejeződése hasonló maradt (1C. Ábra). A viszketés expressziójának in vitro downregulációja kis interferáló RNS-sel a csontvelő eredetű makrofágokban és a RAW 267.4 sejtekben, egy egér makrofág sejtvonalban, az IL-1β és az EMR1 csökkenését és az IL-10 expresszió növekedését eredményezte. LPS és IFN-γ kombinációja, míg az IL-4 stimuláció után csak az EMR1 csökkenését tapasztaltuk (Kiegészítő 1B. és C. ábra).

Az Itch -/- egerek metabolikus jellemzése. Hat hetes WT és Itch -/- egerek tápláltak ND-t. Súly (A) és vércukor-koncentráció (B) (n = 8 csoportonként; ** P -/- egerek

Az ITCH fehérje reprezentatív Western blot elemzése zsírszövetben (AT), izolált adipocitákban (adipocita frakció [AF]) és SVF-ekben (A). Az ITCH fehérje reprezentatív Western blot elemzése AT-ban, izolált adipocitákban (AF) és SVF-ekben (B). A képek reprezentatívak az öt alanyból gyűjtött zsírszövet-metszetekre. CLS, koronaszerű szerkezet; ma, makrofág. A nyilak ITCH- és CD3-pozitív sejteket jelölnek. Korreláció az Itch és a CD-206 mRNS (C) expressziója (r = −0,36, P = 0,01) és a CD206 – CD68 arány (D) között (r = −0,42, P = 0,003) az emberi zsírszövetben (n = 50 ). Az mRNS expresszióját valós idejű PCR-rel határoztuk meg, és normalizáltuk ciklofilin A. R. U. relatív egységekre; Áfa, zsigeri zsírszövet.

Vita

A zsírbiopsziák keresztmetszeti elemzése egyértelműen összekapcsolta a viszketés szintjét a zsírszövet gyulladásával, különösen az M2/M1 aránnyal, amelyet két jól elfogadott marker alkalmazásával fejeztek ki ezekhez a makrofág polarizációs állapotokhoz.

Megállapítottuk, hogy a HFD megszakításakor az Itch -/- egerek hajlamosak voltak fenntartani a súlyukat. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a viszketési hiány elhízásra gyakorolt hatását az étrend okozta gyulladás közvetíti, és nyilvánvalóan gyulladásos inger (HFD) hiányában a viszketés hiánya nem befolyásolja az egerek metabolikus fenotípusát. Eredményeinket terápiás perspektívába fordítva csábítónak találjuk a Th2 válaszra, mint elhízás kezelésére és annak metabolikus folytatásaira spekulálni bizonyos körülmények között (27). A gyulladáscsökkentő anyagcsere-kezelés során alkalmazandó megfelelő étrend szintén releváns kérdés, mivel a lipidek egyes formái köztudottan pozitívan vagy negatívan befolyásolják a gyulladásos választ (28, 29). Az ITCH gátlásának a zsírszövetre gyakorolt hatása additív lehet más utakra, amelyekről bebizonyosodott, hogy relevánsak a csontvázizomzat metabolikus gyulladásának csillapítására, például a TNF-α-konvertáló enzimútra, amelyet a pioglitazon pozitívan korlátoz. Gyulladáscsökkentő hatású PPAR-y agonista, 2-es típusú cukorbetegségben (30,31).

Mivel a viszketés leütése nem befolyásolta az adipogenezist, és csak enyhén zavarta az M1 polarizációt in vitro, és az Itch -/- egerek normális táplálékfelvételt és bélgyulladást nem mutattak ki, csábító arra gondolni, hogy az in vivo megfigyelt védőhatás függ a makrofágok beszűrődésétől az elhízás előrehaladása során a zsírszövetben fordul elő. Mindazonáltal adataink azt sugallják, hogy az ITCH tényezőként hat a Th2 in vivo torzításának és következményeinek elhízásra és metabolikus gyulladásra való visszafogására, különösen akkor, ha lipidekben gazdag étrendet alkalmaznak. Két lehetséges ITCH célpont, amelyet mechanisztikusabb modellekben kell feltárni, a p73 és a promielocita leukémia (PML). Az ITCH köztudottan negatív hatással van a p73-ra (32,33), amely szabályozza a PML fehérje szintjét (34). A PML-hiány az étrend okozta elhízással volt összefüggésben (35,36), és a p73-null makrofágok elfogultak az M1 polarizációjára in vivo (37); előzetesen megfigyeltük, hogy a PML mind WAT-ban, mind BAT-ban nőtt Itch -/- egerekben (5. ábra), amely támogatja a PML szerepét az anyagcserezavarokban, bár további vizsgálatok szükségesek annak megértéséhez, hogy az ITCH/p73/PML útvonal monocita/makrofág vagy adipocita szinten hat.

Eredményeink megerősítik annak bizonyítékát, hogy a zsírszövet makrofág által közvetített gyulladása fontos szerepet játszik az elhízás és metabolikus szövődményeinek kialakulásában. A Th2/M2 torzítás Itch -/- egerekben a zsírszövetbe beszivárgó makrofágok krónikus M2 polarizációját okozza, megvédve a súlygyarapodástól és az ebből következő anyagcserezavaroktól az obesogén inger alatt. Adataink együttvéve meghatározzák az ITCH által közvetített utak szerepét a veleszületett immunitás és az anyagcsere közötti komplex kölcsönhatások szabályozásában.

Cikk információk

Finanszírozás. Ezt a tanulmányt részben a Fondazione Roma 2008, az ESFD/Lilly 2012, az AIRC 2012 IG 13163, az FP7-Health-241913 FLORINASH, az FP-7 EURHYTHDIA és a PRIN 2009FATXW3_002 finanszírozta M.Fe-nek; SAF-2012-33014 a Ministerio de Economía y Competitividadtól (Spanyolország) B.P-ig; és Orvosi Kutatási Tanács, Egyesült Királyság, az ACC12, MIUR/PRIN (20078P7T3K_001)/FIRB (RBIP06LCA9_0023, RBIP06LCA9_0C), AIRC (2011-IG11955) és AIRC 5xmille (MCO # 9979), Telethon grant, GGPO9133 miniszter -IRCCS (RF08 c.15, RF07 c.57) GM-re.

Érdeklődési kettősség. A cikk szempontjából lényeges összeférhetetlenségről nem számoltak be.