Az étrendi többszörösen telítetlen zsírsavak növelik a túlélést és csökkentik a baktériumok terhelését a szeptikus Staphylococcus aureus fertőzés során, és javítják a neutrofil funkciót egerekben

ABSZTRAKT

BEVEZETÉS

A neutrofilek az első immunsejtek, amelyek a gyulladás helyére érkeznek (11). Képesek elnyelni nagyszámú baktériumot, de túl aktívak is szövetkárosodást okozhatnak a gazdaszervezetben (12). A neutrofilek fontosak a S. aureus fertőzések elleni védekezésben. Proinflammatorikus citokinek, például TNF-a, IL-1 és IL-6, valamint a CXCR2 kemokinreceptorhoz kötődő kemokinek vonzzák őket a fertőzés helyeire (13).

Számos tanulmány jelzi, hogy az étkezési zsírösszetétel jelentősen befolyásolja a biológiai funkciókat és az egészséget. A telített és telítetlen étkezési zsírsavak közötti megoszlás változásai különösen fontosnak tűnnek a szív- és érrendszeri és anyagcsere-betegségek szempontjából (14, 15). Az étrendi zsírok szintén fontosak lehetnek a fertőzések elleni immunvédelem szempontjából. Korábban megfigyeltük, hogy a telített, magas zsírtartalmú étrenddel (HFD-S) táplált egerek túlélése csökkent, ha szeptikus S. aureus fertőzésnek vetik alá őket, összehasonlítva az alacsony zsírtartalmú étrendet (LFD) táplált egerekkel (16). Ezenkívül a HFD-S-vel táplált egerek megnövekedett baktériumterhelést mutattak, ami arra utal, hogy immunrendszerük csökkent képességgel képes megakadályozni a baktériumok túlélését és replikációját az LFD-vel táplált egerekéhez képest (16 Jelen tanulmányunk célja annak összehasonlítása volt, hogy a többszörösen telítetlen és telített étkezési zsírok hogyan befolyásolják a túlélést és az immunválaszt a szepszisben. Azt is megvizsgáltuk, hogy az étkezési zsírok hogyan befolyásolják a neutrofilek gyakoriságát és működését, a szepszis és a S. aureus fertőzések elleni védekezés kulcsfontosságú sejtjeit.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Kísérleti protokoll. A kísérleti elrendezést az 1. ábra mutatja. Hathetes kan C57BL/6 hím egereket a Harlan Netherlands B.V.-től (Horst, Hollandia) szereztünk be. Az egereket a kísérleti biomedicina laboratóriumában, a svédországi Göteborgi Egyetemen, Göteborgban, normál fény- és hőmérsékleti körülmények között helyeztük el. A vizet és az ételt ad libitum biztosították. A göteborgi egyetem regionális etikai bizottsága a vizsgálatok megkezdése előtt jóváhagyta a kísérleteket. 7 hetes kortól kezdve az egereket 8 héten keresztül LFD-vel, HFD-S-sel vagy többszörösen telítetlen, magas zsírtartalmú étrenddel (HFD-P) táplálták. 14-15 hetes korban az egereket immunfunkciók mérése céljából leállítottuk áramlási citometriával vagy microarray elemzéssel, vagy intravénásan (i.v.) beoltva S. aureusszal. A fertőzött egereket a 6. napon megszakítottuk iv. oltás a baktériumterhelés elemzésére vagy a túlélési kísérletek végén a 17. napon. A túlélést naponta ellenőriztük a túlélés és a baktériumterhelési kísérlet során.

Kísérleti terv. Hét hetes egereket randomizáltak a különböző étrendcsoportok egyikébe. 8 hét diéta után, a 15. héten az egereket iv. beoltva S. aureus-szal, intraperitoneálisan (i.p.) thioglikoláttal injektálva a peritoneális mosáshoz, vagy befejezve a csontvelő és a vér gyűjtéséhez áramlási citometriás elemzés céljából. Egerek iv. a S. aureus-szal beoltott baktériumokat 6 nap elteltével leállítottuk a baktériumterhelés elemzésére, vagy folyamatosan figyeltük 17 napig a túlélési elemzés céljából. A tioglikoláttal injektált egereknek 4 óra múlva abbahagytuk, és a peritoneális öblítőfolyadékot elemeztük. A kísérleti csoport rövidítései a következők voltak: LFD, alacsony zsírtartalmú étrend; HFD-S, telített, magas zsírtartalmú étrend; HFD-P, többszörösen telítetlen, magas zsírtartalmú étrend; HP/C - HFD-S, magas fehérje/szénhidrát arány és telített, magas zsírtartalmú étrend; LP/C - HFD-S, alacsony fehérje/szénhidrát arány és telített, magas zsírtartalmú étrend; HP/C - HFD-P, magas fehérje/szénhidrát arány és többszörösen telítetlen, magas zsírtartalmú étrend; és LP/C - HFD-P, alacsony fehérje/szénhidrát arány és többszörösen telítetlen, magas zsírtartalmú étrend.

Egy utólagos vizsgálatban négy másik étrendet alkalmaztak 8 héten keresztül. Ezeket a diétákat arra tervezték, hogy megvizsgálják, hogy a fehérje és a szénhidrát aránya befolyásolja-e a túlélést, ha a zsírforrás és mennyiség állandó marad. Az új étrendek tartalmazzák a magas fehérje/szénhidrát arányú HFD-S-t (HP/C HFD-S; 30% fehérje, 10% szénhidrát), a HFD-S-t alacsony fehérje/szénhidrát aránnyal (LP/C HFD) -S; 10% fehérje, 30% szénhidrát), HFD-P magas fehérje/szénhidrát aránnyal (HP/C HFD-P; 30% fehérje, 10% szénhidrát) és alacsony fehérjetartalmú HFD-P- szénhidrát arány (LP/C HFD-P; 10% fehérje, 30% szénhidrát). Ezeket a diétákat ugyanolyan protokoll szerint tápláltuk, mint az előző étrendeket. 15 hetes korban az egerek iv. S. aureusszal oltottuk be, és a túlélést naponta ellenőriztük az oltást követő 17. napig, amikor a túlélési kísérletet befejeztük.

Fogyókúrák. Az egereket véletlenszerűen csoportokra osztottuk, amelyek a következő étrendek egyikét kapták: LFD (D12450B; 3,9 kcal/g, 10 kcal% zsír, 20 kcal% fehérje, 70 kcal% szénhidrát; Research Diets, New Brunswick, NJ, USA), HFD-S (D12492; 5,2 kcal/g, 60 kcal% zsír, 20 kcal% fehérje, 20 kcal% szénhidrát; Kutatási étrend) és HFD-P (D09020505; ugyanaz az összetétel, mint a zsír, fehérje és szénhidrát HFD-S-je), de a sertészsír 69% -át menhadenolajra cserélték; Research Diets). Az étrendeket a zsírösszetétel kivételével hasonló tartalmúak voltak. A diéták összetételét az 1. táblázat mutatja.

A kísérleti étrendek energiasűrűsége és összetétele: telített és többszörösen telítetlen étrend

A különböző fehérje- és szénhidrát-eloszlás hatását vizsgáló kísérlethez egércsoportokat 8 hétig 30 kcal% fehérjét és 10 kcal% szénhidrátot vagy 10 kcal% fehérjét és 30 kcal% szénhidrátot tápláltak. Ezt a két étrendet 60 kcal% telített étkezési zsírral (HP/C HFD-S [D13091403] és LP/C HFD-S [D13091404]; Kutatási étrend) vagy 60 kcal% többszörösen telítetlen zsírral (HP/C HFD-P) kombináltuk. [D13091405] és LP/C HFD-P [D13091406]; Kutatási étrend]. Ezen étrendek összetételét a 2. táblázat mutatja.

A kísérleti étrendek energiasűrűsége és összetétele: fehérje- és szénhidrát-étrend

Baktériumok beoltása, túlélése és baktériumterhelése. Az egereket iv. a farokvénában 0,2 ml S. aureus LS-1 oldattal, amely 3,8x107 - 4,5x107 CFU-t tartalmaz, a korábban leírtak szerint (16). A baktériumok terhelésének meghatározásához az egereket 6 nappal iv. oltást, és mindkét vesét aszeptikusan gyűjtöttük, homogenizáltuk és foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS) hígítottuk a megfelelő koncentrációig. Ezután minden hígított mintából 100 μl-t adagoltunk lóvér-agar lemezekre, amelyeket 24 órán át 37 ° C-on inkubáltunk, mielőtt a baktériumtelepeket megszámoltuk. A túlélési kísérletben az egereket monitorozták és megvizsgálták súlyos betegség jelei (mozdulatlan, izoláció, piloerekció, dehidráció és hipotermia) után iv. oltás. Amikor az egérnek az öt jelből három vagy több mutatkozott, az egeret eutanizálták, és halottnak tekintették a szepszisben.

Testtömeg és testösszetétel. A testsúlyt a diéták kezdetétől és minden második héten az oltásig figyeltük. A zsír és a sovány testtömeget 3 nappal az oltás előtt elemeztük kettős energiájú röntgenabszorpciós módszerrel (PIXImus2; Lunar GE Medical Systems, Madison, WI, USA). Az egereket a mérés során izofluránnal (Forene; Abbot Scandinavia, Solna, Svédország) inhaláltuk.

Áramlási citometria. i. A csontvelő és a vér összegyűjtése. A meg nem fertőzött egereket érzéstelenítettük, mielőtt a vért transzkardiálisan EDTA csövekbe gyűjtöttük volna, majd sóoldattal 100 perc Hg nyomáson 10 percig perfundáltuk. A csontvelő sejteket combcsontból és sípcsontból gyűjtöttük, és PBS-ben tároltuk. A vér- és csontvelőmintákat az előkészítésig jégen tartottuk.

(ii) Peritoneális öblítőfolyadék gyűjtése. A peritonealis mosáshoz használt nem fertőzött egereket 1 ml 4% -os sörfőzésű tioglikolát-táptalajjal (SigmaAldrich, St. Louis, MO, USA) injektáltuk a peritonealis üregbe, hogy helyi gyulladást indukáljunk. Az injekció beadása után négy órával az egereket izofluránnal (Abbot Scandinavia) érzéstelenítjük és méhnyak diszlokációval leöljük. Öt ml hideg PBS-t injektáltunk a hasüregbe, és hasi masszázst végeztünk 1 percig. A PBS-t visszaemlékeztük, és az eljárást kétszer megismételtük, a peritonealis öblítőfolyadék teljes térfogata 15 ml volt. A mintákat az előkészítésig jégen tartottuk.

Microarray elemzés és adatgyűjtés. A csontvelő sejteket a combcsontból és a sípcsontból gyűjtöttük össze, a csontokat RNAlaterrel öblítve (Life Technologies). A mintákat a cég ajánlása szerint egy éjszakán át hűtőszekrényben hagyták, centrifugálták és az elemzésig fagyasztva tartották. Az RNS-t az RNeasy lipid szövetkészlet (Qiagen Nordic, Sollentuna, Svédország) segítségével izoláltuk, az RNS mennyiségét és minőségét pedig a NanoDrop (Thermo Scientific, Göteborg, Svédország) és a Bioanalyzer (Agilent Technologies, Kista, Svédország) eszközökkel értékeltük. Minden mintából kétszáz ng kiváló minőségű RNS-t készítettünk és hibridizáltunk Affymetrix egérgén 1.0 ST tömbökhöz az Affymetrix ajánlott protokollja szerint. A hibridizációt és az elemzést a gyártó utasításai szerint hajtottuk végre a SCIBLU Genomics központi létesítményében (Swegene Integratív Biológiai Központ, Lund Egyetem, Lund, Svédország).

EREDMÉNYEK

A HFD-P fokozta a katepszin D gén expresszióját a csontvelőben. A katepszin D expressziós szintje a csontvelőben végzett mikroarray elemzésből, fertőzött egerekben a különféle étrendek 8 hetes kezelése után. Az adatokat mérsékelt Student-féle t-teszt alkalmazásával értékeltük, és átlagként ± SEM-ként tüntettük fel, n = 4 csoportonként. Két csillag azt jelzi, hogy a fehérje/szénhidrát korrigált P-értéke nem befolyásolta a túlélést. Annak megvizsgálására, hogy a fehérje és a szénhidrátok aránya befolyásolja-e a szepszisben a túlélést, a 60% zsírtartalmú étrendeket - többnyire telített vagy többszörösen telítetlen - 30% fehérjével és 10% szénhidráttal (HP/C) vagy 10% fehérjével és 30% szénhidráttal kombinálták (LP/C) és 8 hétig etettük egerekkel. Nem volt különbség a túlélésben az iv. S. aureus beoltása telített zsírsavakkal táplált egerek között, kombinálva a fehérje és szénhidrát két különböző arányának, a HP/C HFD-S vagy az LP/C HFD-S kombinációjának. Hasonlóképpen nem volt különbség a többszörösen telítetlen zsírsavakkal táplált egerek között, kombinálva a fehérje és szénhidrát két különböző arányának, a HP/C HFD-P vagy az LP/C HFD-P egyikének sem (7. ábra). A túlélési arány azonban magasabb volt (kockázati arány, 0,17; P = 0,001) többszörösen telítetlen zsírsavakkal táplált egerekben, mint telített zsírsavakkal tápláltak esetében, összhangban a 2A. Ábrán bemutatott eredményekkel.

A fehérje vagy a szénhidrát összetétele nem befolyásolta a túlélést. Megállapítottuk a túlélést 8 hét múlva különböző diétákon, 0–17 nappal a S. aureus i.v. oltás, n = 20 egérrel csoportonként. A Cox regressziót a zsírforrás és a fehérje arányának tényezőként hajtották végre, ahol a többszörösen telítetlen zsírsav-diéták kockázata csökkent a telített zsírsav-étrendhez képest (kockázati arány, 0,17; P = 0,001), és a magas fehérjetartalmú étrendben nem volt különbség a kockázatban. a magas szénhidráttartalmú étrend (kockázati arány, 0,8; P = 0,6). ***, P S. aureus fertőzés. A HFD-P-vel táplált egerek túlélési szintje magasabb volt, mint a HFD-S-vel táplált egereké, és a túlélés nem különbözött az LFD-vel táplált egerektől. Ezzel összhangban a HFD-P-vel és az LFD-vel táplált egereknek kisebb volt a baktériumok terhelése a veséjükben, mint a HFD-S-vel táplált egereknek, ami azt jelzi, hogy a HFD-P-vel vagy LFD-vel táplált egerek jobban védenek az S. aureus által kiváltott szepszis ellen. Ezek a megállapítások megerősítik és kiterjesztik korábbi vizsgálatunkat, amely az immunválasz károsodását mutatja HFD-S-vel táplált egerekben, összehasonlítva az LFD-vel táplált egerekkel (16). Ez a tanulmány azt sugallja, hogy a magas zsírtartalmú étrend önmagában nem feltétlenül káros, sokkal inkább az, hogy a zsír magas fokú telítettsége rontja az immunválaszt.

Tekintettel arra, hogy a HFD-S diéta 8 hetes expozíciója elhízást vált ki, az S. aureus elleni immunválasz károsodását közvetlenül az étrend okozhatja, vagy másodlagos lehet az elhízás szempontjából. Korábbi tanulmányaink azt mutatják, hogy az elhízás önmagában befolyásolja a S. aureus által kiváltott szepszis elleni védekezést, mivel az LFD-n lévő ob/ob (elhízott) egerek túlélési szintje alacsonyabb, mint a vad típusú egereké (16). Jelen eredmények azonban arra utalnak, hogy a HFD-P az elhízásra gyakorolt hatásától függetlenül véd a fertőzések ellen. Bár a HFD-P-vel táplált egerek elhízottabbak voltak, mint az LFD-vel táplált egerek, a HFD-P- és az LFD-vel táplált egerek között nem volt különbség a túlélésben. Továbbá nem volt különbség a sovány tömegben a három csoport között, ami azt jelzi, hogy a testösszetétel ezen aspektusa nem közvetíti az étrend hatását a szepszis elleni védekezésre.

Annak megvizsgálására, hogy a neutrofilek migrációs képességét is befolyásolja-e az étrend, tioglikolátot injektáltak a hasüregbe. Valóban, a HFD-P-vel és LFD-vel táplált egerek peritonealis mosófolyadékában a neutrofilek gyakorisága megnőtt, összehasonlítva a HFD-S-vel etetett egerekével, ami azt jelzi, hogy ezekben az egerekben a neutrofilek megnövekedett migrációs képességgel bírnak. Ez a megállapítás akkor is jelen volt, ha figyelembe vettük, hogy a HFD-P-vel táplált egerekben a csontvelőben a neutrofil gyakoriság nőtt, összehasonlítva az LFD-vel vagy HFD-S-vel etetett egerekkel (az adatokat nem mutatjuk be).

A HFD-P-vel táplált egerekben a csontvelő neutrofiljeinek növekedése arra késztetett bennünket, hogy vizsgáljuk meg a progenitor sejteket ebben a szervben. A HFD-P-nek magasabb volt a prekurzor sejtjeinek gyakorisága, mint a HFD-S-vel táplált egerekben. A CD117 vagy a c-Kit az őssejtfaktor/acélfaktor receptorai, és átfogó vérképző prekurzor sejtjelző (26). Feltételezzük, hogy a HFD-P-vel táplált egerek felkészültebbek a leukocita-védelem gyors mozgósítására a baktériumok elleni küzdelem érdekében a magasabb vérképző prekurzor sejtek miatt.

A katepszin D egy lizoszomális fehérje, amely megtalálható a polimorfonukleáris leukocitákban, monocitákban és makrofágokban (27), és fontos az apoptózis szabályozásában (22, 28). Jelen tanulmányban a HFD-P-vel táplált egereknél magasabb a katepszin D-mRNS szintje a csontvelőben, mint a HFD-S-t tápláló egerekben. Korábbi tanulmányok azt mutatják, hogy a katepszin D-hiány a baktériumok kiürülésének romlásához vezet (29, 30). Ez összhangban van eredményeinkkel, ahol a HFD-P-vel táplált egereknek magasabb a katepszin D expressziója és csökkent a baktériumterhelésük.

Korábban felmerült, hogy az étkezési fehérje és a szénhidrátok aránya befolyásolja az immunrendszert (31–33). A jelenlegi vizsgálatban a fehérje/szénhidrát arány nem befolyásolta a szepszis során a túlélést. Ehelyett a telített és többszörösen telítetlen zsír arányának volt nagy hatása, összhangban a fent tárgyalt eredményekkel. Összességében a jelen tanulmány eredményei azt mutatják, hogy a telített és többszörösen telítetlen zsírsavak közötti megoszlás robusztus hatást gyakorol a szeptikus túlélésre, függetlenül az étrend fehérje- és szénhidráttartalmának nagy eltéréseitől.

Összefoglalva, úgy tűnik, hogy a HFD-P-vel táplált egerek nagyobb képességgel rendelkeznek az S. aureus fertőzés leküzdésére, mint a HFD-S-vel táplált egerek. Ennek oka ismeretlen, de összefüggésbe hozható azzal a ténnyel, hogy a HFD-P-vel táplált egereknél a fertőzés előtt a neutrofilek gyakorisága nagyobb volt a csontvelőben és a vérben. Ezenkívül a HFD-P-vel táplált egereknél a neutrofilek gyakorisága nagyobb volt a peritoneális öblítőfolyadékban a tioglikolát által kiváltott gyulladás után; így úgy tűnik, hogy ezeknek az egereknek hatékonyabb a kemotaxisa, mint a HFD-S-vel táplált egerek neutrofiljeinek.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Ezt a munkát a Svéd Kutatási Tanács (sz. K2013-54X-09894-19-3) és az Európai 7. keretprogram támogatása (Full4Health; szerződésszám: FP7-KBBE-2010-4-266408) támogatta.

Elismerjük a svéd Lund Egyetem SCIBLU Genomics-ját (Swegene Integratív Biológiai Központ) a mikroarray hibridizációkért.

Megerősítjük, hogy nincsenek összeférhetetlenségeink.