Az emberi sovány anyagcsere-társult zsírmájbetegség (MAFLD) keringő hiszton-aláírása

Absztrakt

Háttér

Bár a metabolikus társult zsírmájbetegség (MAFLD) összefügg az elhízással, sovány betegeknél is előfordulhat. A MAFLD agresszívebb a sovány betegeknél, mint az elhízott betegek, magasabb a halálozás kockázata. A differenciálisan sovány vagy túlsúlyos MAFLD diagnosztizálására specifikus biomarkerek hiányoznak. A hisztonok és nukleoszómák felszabadulnak a véráramban sejthalál esetén. Itt egy új, gyors, képalkotó és epigenetikai alapú megközelítést javasolunk a steatosis súlyosságának vizsgálatára karcsú MAFLD betegeknél.

Eredmények

Összesen 53 nem elhízott beteget vettek fel szövettanilag igazolt MAFLD diagnózissal. Húsz betegnél steatosis 1. fokozat (0–33%), 24 steatosis 2. fokozatú (34–66%) és 9 3. steatosisos (67–100%) beteg volt. A keringő nukleoszómák szintjét enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálattal, míg az egyes hisztonokat vagy hiszton dimereket szérum mintákban egy új, fejlett áramlási citometriával, ImageStream (X) -hez adaptált módszerrel vizsgáltuk. A keringő nukleoszóma szintek rosszul társulnak a MAFLD-vel, elhízás hiányában. Sikeresen megvalósítottunk egy többcsatornás áramlási módszertant az ImageStream-en (X), az egyetlen hiszton festés (H2A, H2B, H3, H4, macroH2A1.1 és macroH2A1.2) leképezéséhez. Itt beszámolunk a microH2A1.1 és a macroH2A1.2 hiszton variánsok szintjének jelentős kimerüléséről a sovány MAFLD betegek szérumában, külön-külön vagy H2B-vel komplexben.

Következtetések

Összefoglalva, egy új, keringő hiszton aláírást azonosítottunk, amely képes megkülönböztetni a steatosis súlyosságát a sovány MAFLD-ben szenvedő egyéneknél, gyors és nem invazív ImageStream (X) alapú képalkotó technológiával.

Háttér

Eredmények

A szérum nukleoszóma szintje és a nem elhízott betegek gyenge összefüggése a MAFLD-vel

Nemrégiben bebizonyítottuk, hogy a keringő nukleoszóma szintek erősen asszociálnak az elhízás által kiváltott MAFLD-vel, az ELISA assay-vel meghatározva [15]. Itt arra kerestük a választ, hogy a keringő nukleoszóma szintek társulnak-e a MAFLD-vel a nem elhízott betegek körében. Ebből a célból összesen 53 sovány vagy túlsúlyos, biopsziával igazolt MAFLD-s beteget toboroztak a járóbeteg-rendelőintézetbe [33], és összehasonlították az elhízott vagy elhízott, FLI 4) NAS pontszámmal rendelkező egyénekkel, ami a steatosis pontszámainak összegét jelenti, lobuláris gyulladás és léggömbözés, és 0–8 között mozog [33]) (2. táblázat). Meglepő módon nem találtunk összefüggést a keringő nukleoszóma szintek és a steatosis fokozat, S1-től S3-ig, nem elhízott (sovány + túlsúlyos) (2a. Ábra) és túlsúlyos betegeknél (2b. Ábra), míg sovány betegeknél jelentős növekedés (o = 0,018) S3 vs S1 egyedekben detektáltunk (2c. Ábra). Hasonlóképpen, a keringő nukleoszóma szintek közötti különbség a NASH diagnózisa szerint nem volt nyilvánvaló (2d – f. Ábra). Összességében ezek az adatok azt sugallják, hogy a szérum nukleoszóma szintje nem elhízás hiányában nem univerzális markere a MAFLD és a NASH.

Az ImageStream (X) optimalizálása a keringő hiszton és hiszton komplexek kimutatására

Az Alexa Fluor® 488 háromféle keringő tárgy reprezentatív képe, méreteloszlása és fluoreszcencia jelintenzitása (a-én) és sejtek (k-m) pozitív a H2A expresszió szempontjából. Az ImageStream fényképek fényes mezőt és H2A festést mutatnak (fluoreszcencia az Alexa Fluor® 488-tól)

A H2A rekombináns mag hisztonok Alexa Fluor® 488 reprezentatív képei, méreteloszlása és fluoreszcencia jelintenzitása (a-c), a H4 rekombináns mag hisztonok (d-f) és az emberi natív nukleoszómák fehérje (g-én) pozitív a H2A (H4) expresszió szempontjából. Az ImageStream fényképek fényes mezőt és H2A (H4) festést mutatnak (fluoreszcencia az Alexa Fluor® 488-tól)

A keringő makro H2A1.2, H2B és H4 hisztonok jelzik az emberi sovány alkoholmentes zsírmáj betegség súlyosságát

Reprezentatív képek, méreteloszlás és fluoreszcencia jelintenzitás a kanonikus hisztonok (H2A, H2B, H3, H4) és a H2A hiszton 2 nagy variánsának fluoreszcencia markeréből (macroH2A1.1 és macroH2A1.2). Az ImageStream fényképek fényes terű képeket és hiszton festést mutatnak (fluoreszcencia: Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 549, Alexa Fluor® 594 vagy Alexa Fluor® 647)

Reprezentatív képek, méreteloszlás és fluoreszcencia jelintenzitás az Alexa Fluor® 488 és az Alexa Fluor® 594-ből, többcsatornás makroH2A1.2/H2B hiszton detektálásával. Az ImageStream fényképek fényes terű képeket, makro H2A1.2 hiszton festést (fluoreszcencia az Alexa Fluor® 488-tól), H2B hiszton festést (fluoreszcencia az Alexa Fluor® 594-től) és összetett képeket, makró H2A1.2 és H2B festéseket mutatnak be.

Vita

A makroH2A1.1 és a makroH2A1.2 izoformák a makroH2A1 alternatív spliceléséből származnak. A makroH2A1.1 makrodomén specifikusan megköti a nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD +) származékú metabolitjait, például az ADP-ribózt és az O-acetil-ADP-ribózt: ez az ADP-ribóz megkötése lehetővé teszi a makroH2A1.1 interakcióját az aktivált PARP1 enzimmel [42]. Másrészt a makroH2A1.2 és a makroH2A2 izoformák nem képesek megkötni ezeket a metabolitokat [42].

Az ADP-ribóz metabolizmusának szerepe az anyagcsere szabályozásában és a lipid felhalmozódásában a perifériás szövetekben egyre inkább felértékelődik [43]: a keringő makroH2A1.1/makroH2A1.2 szint tükrözheti a máj és a zsírszövet ADP-ribóz metabolizmusát. Az egereken végzett korai vizsgálatok azt mutatták, hogy a makroH2A1 lokalizációja gazdagodik a gének testében, amely funkcionálisan csoportosul a lipid anyagcsere területén [44], és a makroH2A1 izoform expressziójának mesterséges manipulálása befolyásolja a sejt lipid felhalmozódását [45]. A sovány MAFLD-ben részt vevő makroH2A1 izoformák és lipid-metabolizmus gének (CETP, PEMT, PNPLA3) [7, 46] közötti potenciális kölcsönhatás még megalapozatlan.

Úgy gondolják, hogy az ép nukleoszómákat haldokló neutrofilek vagy neutrofil extracelluláris csapdáik (NET) szabadítják fel, amint azt nemrégiben megerősítette egy automatizált ImageStream (X) alapú csővezeték, amely lehetővé tette a NET mennyiségi meghatározását a stimulált keringő emberi neutrofilekben [47]. Az ELISA tesztek segítségével kimutattuk, hogy az intakt nukleoszómák az elhízással társult MAFLD [15] erős markerei, a sovány MAFLD vagy a NASH azonban nem. Valószínű magyarázat, hogy a neutrofilek száma a MAFLD-ben szenvedő betegeknél korrelál a BMI túlsúlyos/elhízott MAFLD-vel magasabbnak mondható a sovány MAFLD-hez képest [48, 49]. A máj neutrofil infiltrációja a NASH jellemzője, és feltételezhető, hogy májkárosodással és a betegség előrehaladásával jár együtt reaktív oxigénfajok létrehozásával és proinflammatorikus mediátorok előállításával [50]; ez a jelenség azonban továbbra is lokalizálódhat, és nem eredményezheti a NET-függő kimutatható szérum nukleoszómák növekedését.

Vizsgálatunk erősségei (i) a MAFLD biopsziával igazolt diagnózisán alapulnak, amely kétségtelenül lehetővé tette a klinikai fenotípus szövettani validálását és a hisztonszinttel való összefüggéseket, és (ii) egy költséghatékony, gyors képalkotási protokoll létrehozására, amely megköveteli minimális mennyiségű szérum/vér. Vizsgálatunknak vannak olyan korlátai is, amelyek magukban foglalják az alacsony mintaméretet, különösen az ImageStream (X) alapú elemzéshez. Valójában a hisztonszintek összehasonlítását korlátozott mintanagysággal végezték (azaz 9 beteg steatosis fokozatú csoportonként), ami elegendő volt a hisztonszint 70% -os változásának kimutatásához. Ezért elemzésünk nem volt képes kimutatni egy kis különbséget az 1. és 3. steatosisos betegek között. Ugyanezt a BMI-kategóriák szerint rétegzett összehasonlítást még óvatosabban kell értelmezni, ezért további nagyszabású tanulmányokat kell ösztönözni ígéretes eredményeink megerősítésére. Ugyanezen okból a korlátozott mintaméret nem tette lehetővé számunkra a további kovariánsok figyelembe vételét. Noha részben megoldottuk ezt a kérdést, a két csoport életkor, nem és BMI összevetésével, az egyéb klinikai és személyes jellemzők hatását figyelembe kell venni a további kutatásokban.

Valójában az elhízásban és metabolikus szindrómában szenvedő egyéneknél gyakran előforduló multi-morbiditások hatása a keringő hiszton komplex összetételére még nem tisztázott: nagyobb mintaméret szükséges a keringő hisztonok közötti kapcsolat meghatározásához, MAFLD kórosan elhízott egyéneknél.

Összefoglalva: egy új ImageStream (X) módszertani megközelítéssel azonosítottunk egy keringő hiszton-aláírást, amely, ha különböző és eltérő etnikai háttérrel és életkorral rendelkező nagyobb és független kohorszokban érvényesül, hasznos lehet a steatosis súlyosságának diagnosztizálására sovány MAFLD-s betegeknél. Ezzel a megközelítéssel a keringő hiszton komplexek kényelmesen és átfogóan vizsgálhatók, ezáltal új fenotípusos és funkcionális betekintést nyújthatnak a karcsú egyénekben felmerülő egyedi MAFLD-re.

Mód

Vizsgálati populáció

Összesen 53 nem elhízott, metabolikusan társuló zsírmájbetegség (MAFLD) beteget vettek fel a Római Szent Szív Katolikus Egyetemének májbetegségének járóbeteg-rendelőjéből. A testtömeg-indexet (BMI) súly (kg)/magasság (m) formájában számoltuk. A derék kerületét szokásos eljárásokkal mértük. Az alanin-transzaminázt (ALT), az aszpartát-transzaminázt (AST), a triglicerideket, a teljes, nagy sűrűségű lipoproteint (HDL) és az alacsony sűrűségű lipoprotein (LDL) koleszterint standard laboratóriumi módszerekkel mértük. Az éhomi glükózt és az éhomi inzulint automatizált kereskedelmi módszerekkel is értékeltük. Az IR-t homeosztatikus modellértékeléssel (HOMA) értékelték [HOMA-IR = (inzulin (μIU/ml) × glükóz (mmol/l))/22,5)]. A 2,5-es határértéket az IR indexének tekintették [51].

A májbiopsziák pontozását független patológusok végezték, akik nem voltak tisztában a beteg állapotával. A MAFLD szövettanilag igazolt diagnózisával [33] rendelkező, túlsúlyos, de nem elhízott felnőtt betegeket az alábbiak szerint választottuk ki: 21 1. fokozatú steatosisban szenvedő beteget (0–33%), 24 2. fokozatú steatosisban szenvedő beteget (34–66%) és 9 steatosis 3. fokozatú betegek (67–100%). A májkárosodás minden egyéb okát, a lipid felhalmozódás kivételével, kizárták. Valamennyi beteg negatív volt a hepatitis B és a hepatitis C szerológiai markerek tekintetében, alkoholfogyasztási szintjük volt

Az adatok és anyagok rendelkezésre állása

A jelenlegi vizsgálat során felhasznált és/vagy elemzett adatkészletek ésszerű kérésre a megfelelő szerzőtől elérhetőek.