Az ellenállási gyakorlat megfordítja az öregedést az emberi csontváz izomzatában

Egyformán járult hozzá ehhez a munkához: Simon Melov, Mark A. Tarnopolsky

* Kinek kell címezni a levelezést. E-mail: [email protected] (SM); [email protected] (MT)

Buck Buck Institute for Age Research, Novato, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok

Egyformán járult hozzá ehhez a munkához: Simon Melov, Mark A. Tarnopolsky

* Kinek kell címezni a levelezést. E-mail: [email protected] (SM); [email protected] (MT)

Tagság McMaster Egyetem, Gyermekgyógyászati és Orvostudományi Tanszék, Hamilton, Kanada

Genetikai Tagsági Központ, Gyermekkórház Oakland Kutatóintézet, Oakland, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok

Buck Buck Institute for Age Research, Novato, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok

Simon Melov,
Mark A. Tarnopolsky,
Kenneth Beckman,
Krysta Felkey,
Alan Hubbard

Ábrák

Absztrakt

Itt számolunk be arról, hogy az egészséges, idősebb felnőttek gén expressziós profilt mutatnak a vázizomban, összhangban a mitokondriális diszfunkcióval és a kapcsolódó folyamatokkal, például a sejthalállal, a fiatalokkal összehasonlítva. Ezenkívül egy idősebb felnőtteknél végzett ellenállási gyakorlat után azt tapasztaltuk, hogy az életkorral összefüggő transzkriptóm expresszió változásai megfordultak, ami egy fiatalos kifejezési profil helyreállítását vonja maga után.

Eredmények

Először azt kérdeztük, hogy van-e statisztikailag szignifikáns differenciál gén expresszió fiziológiailag normális betegségtől mentes vázizomzatban fiatal és idős egyének között (S1. Táblázat). 596 gént azonosítottunk, amelyek statisztikailag szignifikánsan differenciáltan expresszálódtak a két korcsoport közötti 5% -os hamis felfedezési arány (FDR) alkalmazásával (S2. Táblázat).

Rendezett távolságmátrix a HOPACH algoritmus segítségével [53] szignifikánsan differenciáltan expresszált gének fiatal és öreg vázizmokban (FWER 2. ábra. A gyakorlat megfordítja az idősek funkcionális csökkenését.

Minden pont azt az egyént képviseli, aki a módszerekben leírt erőnléten esett át. A fiatalok nagyobb képességekkel bírtak a súlyemelésben, mint az idősebbek (p 3. ábra. Az öregedéssel járó génexpressziós változások 6 hónapos edzés után fiatalos szintre fordulnak.

A fiziológiailag normális személyek életkorával összefüggő 596 gén közül ezek közül 179 volt statisztikailag szignifikánsan összefüggésben az 5% FDR mellett gyakorolt testmozgással. a. A génindex az életkorhoz és a testmozgáshoz kapcsolódó 179 gént ábrázolja. Ezeknek a géneknek az expresszióját normalizálták a fiatal értékekhez képest (a fiatal expressziót a grafikonon az 1. pontnál húzott sötét vonal képviseli). Minden gén átlagos relatív expressziója a 14 idősebb egyénen belül látható a fiatalabbakhoz viszonyítva. Az életkorral alacsonyabban szabályozott gének a testmozgással jelentősen megfordulnak a fiatalos szinteken, és az életkorral felülszabályozott gének ugyanazt a tendenciát mutatják, hogy a testmozgással együtt visszatérnek a fiatalos szintre. b. A testmozgással és az életkorral összefüggő gének permutációs tesztje a testmozgással történő statisztikailag szignifikáns fordulat meghatározása érdekében. Az x tengely (log2) az idősebb alanyok edzés utáni génexpressziójának arányát mutatja a fiatalokhoz viszonyítva, a 0 ekvivalens a „fiatal” génexpresszióval. Ez a 4. ábra p-értékét eredményezte. A testmozgás nagyobb valószínűséggel befolyásolja az „öregedő” géneket, mint az életkorral nem összefüggő gének.

Az x-tengely (log2) az edzés előtti génexpresszió utáni arányát mutatja az idősebb alanyok között. A sötét folytonos vonal a testmozgás (post/pre) log2 arányának eloszlását mutatja az életkorral jelentősen összefüggő gének között. A piros vonal egyenértékű eloszlást jelent azoknál a géneknél, amelyek nem társulnak az öregedéssel. Az eloszlások különbségével társított p-érték kisebb, mint 0,0001.

Ezután azt kérdeztük, hogy az életkorral és a testmozgással jelentősen összefüggő gének összefüggenek-e meghatározott erősségekkel? Nem találtunk szignifikáns összefüggést az erő és a génexpresszió között az FDR 25% -os határértékéig, valószínűleg az idősebb egyének edzés utáni kicsi eltérése miatt, korlátozva azon képességünket, hogy specifikus géneket társítsunk az erő specifikus javulásával.

Vita

Adataink határozottan alátámasztják azt a koncepciót, miszerint a mitokondriális diszfunkció az emberek öregedésével jár. A fontos és újszerű megállapítás az, hogy az ellenállást gyakorló edzés megfordítja az öregedő transzkriptóm aláírás számos aspektusát. Ez azt jelenti, hogy az öregedő izmok funkcionális javulása az ellenállás gyakorlása következtében összefügg az öregedés molekuláris aláírásának globális javulásával, különösen a mitokondriális funkcióval kapcsolatos átírások esetében.

Először is összehasonlítottuk a fiatalok és az idősebbek nagy számát, akiket nagyon jól jellemeztek olyan változók szempontjából, mint az étrend és a testmozgás háttere, a gyógyszerek (azaz a sztatinok) hiánya [43] vagy a betegségek (azaz a 2. típusú rák) cukorbetegség) [44], amely megváltoztathatja a mitokondriális funkciót. Másodszor, bioinformatikai megközelítést alkalmaztunk új kifejezési minták felfedezésére. Talán a legfontosabb, hogy bebizonyítottuk, hogy az ellenállást gyakorló edzés az idősebb emberek transzkripciós expressziós profilját a fiatalabb felnőttek.

Végül adataink olyan aláírási kifejezési profilokra mutatnak, amelyek potenciálisan felhasználhatók olyan különféle beavatkozások szűrésére, amelyek visszafordíthatják vagy visszaadhatják az öregedő aláírást a fiatalabb felnőttek felé. Jelölt terápiákat vagy molekulákat, amelyek ígéretet mutatnak, be lehet vonni prospektív kísérletekbe, hogy értékeljék a csontvázizom öregedési arányának modulálásának hatékonyságát egyébként fiziológiailag normális felnőtteknél.

Anyagok és metódusok

Tantárgyi jellemzők és testgyakorlás

A résztvevők maximális izometrikus nyomatékát a jobb lábtól határozták meg fékpad segítségével (Biodex System 3, Biodex Medical Systems, Shirley, NY). Minden tesztet reggel fejeztek be, és az idősebb felnőtteket edzés előtt és az utolsó edzés után 48–72 óra között tesztelték (lásd alább). A vizsgálati módszerek leírását korábban csoportunk adta [10].

Ezeket a tanulmányokat a McMaster Egyetem és a Hamiltoni Egészségtudományi Kutatási Etikai Testület hagyta jóvá, és a Helsinki nyilatkozat alapelveihez igazították, és minden alany írásban megalapozott beleegyezést adott a részvételhez.

Testedzés

Az ellenállást gyakorló edzéseket hetente kétszer, egymást követő napokon (hétfő + csütörtök, vagy kedd + péntek) 26 héten keresztül végeztük az 1. táblázatban felsorolt idősebb egyének 14-ben (a részleteket lásd az S1. . Az edzés előtt és utána az alanyoknak statikus nyújtást kellett végrehajtaniuk. Az egyes gyakorlatok ellenállási gyakorlata 3 ismétlésből állt, 10 ismétlésből; lábprés, mellkasi prés, lábszárnyújtás, lábhajlítás, vállprés, lat lehúzható ülősor, borjú emelés, hasi rángás és hátnyújtás, valamint 10 ismétlés a karhajlításhoz és a kar meghosszabbításához. Az edzés az egyes gyakorlatok egy sorozatából az első 1 ismétlés maximális értékének (1RM) 50% -ában 3 sorozatig haladt az 1RM 80% -án az edzés ideje alatt. Az edzésnaplókat az egyes foglalkozások mennyiségének és intenzitásának feljegyzése céljából tartották. Az 1RM-et kéthetente átértékelték, és ennek megfelelően beállították az edzés terhelését. Az összes gyakorlatot lemezalapú erőnléti edzőeszközökön hajtották végre (Universal Gym Equipment, Inc., Cedar Rapids, Iowa).

Izombiopszia/vérminta

Izombiopsziát vettünk a jobb vagy bal láb vastus lateralis izomzatából (randomizált) edzés vagy immobilizáció (fiatalok, N = 26 összesen) és (N = 25), valamint az edzés után (N = 14). idősebb felnőtteknél, ~ 20 cm-rel a térdízülethez közel, 5 mm-es Bergström biopsziás tű segítségével. Az izmot zsírból és kötőszövetből boncoltuk, azonnal fagyasztottuk folyékony nitrogénben, és későbbi elemzés céljából -80 ° C-on tároltuk. Az alanyoknak az izombiopszia előtt 48 órán keresztül tartózkodniuk kellett a megerőltető fizikai aktivitástól.

RNS extrakció, mikrorajkák és valós idejű PCR

A teljes RNS-t az emberi izomból TRIzol reagenssel (Invitrogen, Carlsbad, CA) extraháltuk, a csoportunk leírása szerint [48]. Röviden: 25–50 mg izomot homogenizáltunk 1 ml TRIzol-reagensben 4 ° C-on, szobahőmérsékleten 5–10 percig hagytuk, majd 0,2 ml kloroformot adtunk hozzá, 15 másodpercig vortexeltük és centrifugáltuk 12 000 fordulat/perc sebességgel. 4 ° C-on 15 percig. A felülúszót egy új csőbe helyeztük, és 0,5 ml izoproponális etanollal összekevertük, ~ 22 ° C-on 10 percig álltunk, és 12 000 fordulat/perc sebességgel 4 ° C-on 10 percig centrifugáltuk. Az RNS-pelletet kétszer mossuk 0,5 ml 75% -os etanollal, levegőn szárítjuk és feloldjuk 14 µl Depc-kezelt ddH2O-ban 2 µl -80 ° C-on tárolt alikvotokkal. Az RNS koncentrációját és tisztaságát UV spektrofotométerrel (Shimadzu UV-1201; Mandel Scientific, Guelph, Ontario) határoztuk meg 260/280 nm abszorbanciánál. A méréseket két példányban végeztük, és az átlagos variációs együttható (CV) 1,5 volt a DNSáz-kezelés előtt. Az RNS integritását egy véletlenszerűen kiválasztott mintarészben értékeltük agaróz gélelektroforézissel, és a 28S és 18S rRNS OD aránya folyamatosan nagyobb volt, mint 1 minden mintánál.

A MAQC (microarray quality control) projekt legújabb tanulmányai jelentős egyetértést mutatnak az illumina mikroarray adatok és a valós idejű PCR adatok között ugyanazon mintákon [49] - [51]. Ugyanakkor bőven van precedens a mikrorajz adatok valódiságára, valós idejű PCR-rel történő „független” megerősítés nélkül (amely számos jelentős technikai problémát okozhat [52]), számos szám valós idejű validálását elvégeztük. gének vizsgálata kulcsfontosságú szempontjainak megerősítésére (S2. ábra). Az RT-PCR-t TaqMan® valós idejű módszerrel fejeztük ki a mikroarray két génjére (S2. Ábra). Röviden, a mintákat 25 percig DNase I-vel kezeltük a szennyező DNS eltávolítása érdekében. Az egyes célgének primereit és szondáit a GenBank cDNS-szekvenciája alapján terveztük meg (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi) a 3. primer tervezővel (http: //frodo.wi. mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi). Valamennyi célgén-próbát 5 'végén FAM-mal, 3'-végén BHQ-1-vel jelöltük. A Duplex RT-PCR-t iCycler valós idejű PCR-rendszeren (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) hajtottuk végre az egylépéses TaqMan® RT-PCR Master Mix Reagensekben (Roche, Branchburg, New Jersey) a gyártás utasításai szerint. célgén láncindítókkal és szondával, valamint belső standard gén láncindítókkal és szondával ugyanabban a reakcióban.

Tömbolvasás

A feldolgozott tömböket BeadStation tömbolvasóval (Illumina) olvastuk le a gyártó utasításainak megfelelően. A beolvasási beállítások egyszínű (zöld) beolvasásra vonatkoztak: Faktor = 2,506, PMT = 561, Szűrő = 100%.

Bioinformatika és statisztika

A kvantilis normalizálás után (limma csomag használatával R-ben) az életkori tömbökön (25 fiatal és 26 idősebb alany, S1. Táblázat) először próbánként elvégezve meghatároztuk az életkorral jelentősen differenciált gének számát, 24354 kétmintás t-teszt. Az Illumina chipekben rutinszerűen körülbelül 30 független replikátum található az egyes génekből (technikai replikátumok), és ezeknek a replikátumoknak az átlagát használtuk. Érdemes hangsúlyozni, hogy ez nagyfokú bizalmat biztosít az egyes génbőségek becsléséhez, mivel a 30-szoros technikai replikáció sokszorosa a génbőség mérésére szolgáló egyéb módszereknek, például a valós idejű PCR-nek. Az itt közölt génexpressziós adatokat a GEO tárolja (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).