Az elhízás a spermatogenezisre gyakorolt ​​hosszú távú hatások révén rontja a férfiak termékenységét

Absztrakt

Célkitűzés

Ennek a tanulmánynak a célja a magas zsírtartalmú étrend okozta elhízás spermatogenezisre gyakorolt ​​hatásának és lehetséges mechanizmusainak vizsgálata hím patkányokban.

Mód

Összesen 45 hím patkányt osztottunk véletlenszerűen kontroll (n = 15, normál étrend) és elhízási csoportok (n = 30, magas zsírtartalmú étrend) és 16 hétig etettük. A testtömeget és a szervi indexeket feláldozás után határoztuk meg. Mértük a reproduktív funkció mutatóit, beleértve a spermiumok számát, a spermiumok mozgékonyságát, a spermatogén sejtek apoptózisát és az oxidatív stressz szintjét. A szérum metabolikus paramétereit és a reproduktív hormonokat is megvizsgáltuk.

Eredmények

A kontroll csoporthoz képest az elhízott patkányok epididymális spermiummotilitása szignifikánsan csökkent (P 0,05).

Eredmények

A táplálkozási elhízás károsíthatja a hím patkányok spermatogenezisét a spermatogenezisre gyakorolt ​​hosszú távú hatások miatt.

Háttér

Az elhízás a testzsír túlzott felhalmozódására utal, ami negatív hatással van az egészségre. Az Egészségügyi Világszervezet (WHO) szerint a testtömeg-index (BMI) 25–29,9 kg/m 2, mint túlsúly, míg a 30 kg/m 2 BMI elhízás. A túlsúly és az elhízás előfordulása meredeken megnőtt [1]. A releváns statisztikai adatok azt mutatják, hogy az elhízott népesség 1980 és 2008 között világszerte megduplázódott, és a népesség több mint 10% -a elhízott [2]. Az elhízás gyakorisága a későbbi felmérések szerint tovább nőtt, a legfrissebb becslés szerint a férfiak 35,2% -a és a nők 40,4% -a elhízott [3].

Az elhízás jól dokumentáltan kapcsolódik olyan betegségekhez, mint a 2-es típusú diabetes mellitus, a szív- és érrendszeri betegségek, a rákos megbetegedések és az alvási apnoe szindróma [4, 5]. A közelmúltban alaposan megvizsgálták az elhízás termékenységre gyakorolt ​​hatását. A jelenlegi vizsgálatok azonban elsősorban az elhízásnak a nőstények vagy nőstény állatok reproduktív működésére gyakorolt ​​hatásaira összpontosítottak, míg a hímeket és hímivarú állatokat kevéssé tanulmányozták [6]. Ezenkívül, míg a legtöbb jelentés az elhízást a reproduktív funkcióval kapcsolatban vizsgálta, a mögöttes mechanizmusokat nem sikerült tisztázni [7, 8]. Ezen túlmenően az elhízás spermaparaméterekre és reproduktív hormonokra gyakorolt ​​hatásaira vonatkozó következtetések különböznek [9] a sok tényező miatt, amelyek befolyásolhatják a férfiak termékenységét. Például egy metaanalízist, amelyet MacDonald és mtsai végeztek. nem talált statisztikailag szignifikáns összefüggést a BMI és a sperma paraméterei között [10], míg egy Sermondade és mtsai által végzett tanulmány. szignifikáns J alakú összefüggést talált a BMI és a kóros spermiumszám között [11]. Ennek a tanulmánynak a célja a spermatogenezis vizsgálata hím patkányokban, elhízással, magas zsírtartalmú étrend alkalmazásával, a kísérleti torzítás minimalizálása és a lehetséges mechanizmusok azonosítása érdekében.

Mód

Állatok

A hathetes hím Sprague-Dawley patkányokat a Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Peking, Kína) biztosította. A patkányok testtömege 130,43 ± 7,15 g. 12 órás nappali/12 órás éjszakai menetrend szerint tartották őket (19: 00-tól 07: 00-ig világít). A hőmérsékletet és a páratartalmat 22 ± 1 ° C-on, illetve 60% -on tartottuk. Az ételt és a vizet ad libitum szolgáltatták, és mindegyik ketrec 5 patkányt tartalmazott. Minden erőnkkel igyekeztünk minimalizálni az állatok szenvedését, és az eutanáziához CO2 belégzést alkalmaztunk.

Kísérleti terv

Összesen 45 hím patkányt vontak be ebbe a vizsgálatba, és véletlenszerűen két csoportra osztották őket, nevezetesen a kontroll csoportra (n = 15, normál étrend) és az elhízás csoport (n = 30, magas zsírtartalmú étrend), amely normál étrendet, illetve magas zsírtartalmú étrendet kapott. A magas zsírtartalmú formula a következő volt [12]: 10% sertészsírolaj, 10% szacharóz, 1,5% koleszterin, 0,5% epesó, 5% sárgája és 73% normál takarmány. A patkányok testtömegét és hosszát minden héten 16 egymást követő héten keresztül mértük. A 16. héten az alsó kvartilisekben lévő patkányok súlygyarapodáshoz (n = 8) kizárták az elhízás csoportjából. Mivel az alsó kvartilis testtömegű patkányok általában elhízási rezisztenciát mutattak, őket is kizárták, és végül 22 elhízott patkányt elemeztek. A megfelelő csoportosítás biztosítása érdekében összehasonlították az általános státuszt a két csoport között. A két csoport általános növekedési állapotát és metabolikus paramétereit összehasonlítottuk a 16. hét végén.

Miután 16 hétig etették a megfelelő étrenddel, az összes patkányt CO2-val altattuk. Vérmintákat vettünk a hasi aortából, centrifugáltuk (2400 fordulat/perc 20 percig 4 ° C-on és fagyasztva -70 ° C-on), és a szérum hormonszintek [luteinizáló hormon (LH), összes tesztoszteron TT), ösztradiol ( E2) és a nemi hormont kötő globulin (SHBG)]. Elemeztük a hereszövet szövettanát, a spermatogén sejtek apoptózisát és a here szöveteinek antioxidáns státusát. A spermiumok számát és a mozgékonyságot a cauda epididymisből származó spermium-szuszpenziókkal határoztuk meg.

Testindex és szervindex értékelések

Kétoldali herét, kétoldali epididimidet és zsigeri zsírt kapunk (körülveszik a vese, a herék és az omentum majus) és megmérik őket. A releváns paramétereket a következőképpen határoztuk meg: Lee index = [súly (g) × 103/testhossz (cm)] 1/3; zsíregyüttható = [zsigeri zsírtömeg (g) × 100%/testtömeg (g)]; és herékegyüttható = [heretömeg (g) × 100%/tömeg (g)].

Szérum biokémiai és hormonvizsgálatok

A szérum SHBG-t enzimhez kapcsolt immunszorbens assay (ELISA) készlettel határoztuk meg, amelyet a pekingi Northern Biological Technology Research Institute-tól (Peking, Kína) szereztünk be. Az LH, T és E2 szérumot radioimmun-vizsgálatokkal (RIA) mértük a pekingi Northern Biological Technology Research Institute (Peking, Kína) által beszerzett készlet segítségével. A szérum szabad tesztoszteront (FT) a Vermeulen képlet segítségével számoltuk ki:

Szövettani vizsgálat

Kis herékarabokat rögzítettünk Bouin oldatában és 70% -os etanolban, dehidratáltuk osztályozott etanolban, fixáltuk 10% -os formalin-oldattal 48 órán át, és kevert mészkőoldószerrel kezeltük. Alkoholos dehidratálás után a combcsontokat paraffinba ágyazták, 5 μm-es szakaszokra vágták és HE-vel festették. A sejtmorfológiát fénymikroszkóppal figyelték meg, és Johnsen-pontszámmal értékelték [13, 14]. A módosított Johnsen-pontozás szövettani kritériumai a következők: teljes spermatogenezis (10. pont), enyhén károsodott spermatogenezis, sok késői spermatida, diszorganálatlan hám (9. pont), tubulánként kevesebb, mint öt spermium, néhány késői spermatida (8. pont), nincs spermatozoa, nincsenek késői spermatidák, sok korai spermatida (7. pont), nincs spermatozoák, nincs késői spermatida, kevés korai spermatida (6. pont), nincs spermatozoa vagy spermatida, sok spermatocita (5. pont), nincs spermatozoa vagy spermatida, kevés spermatocyta (4. pont) ), csak spermatogonia (3. pont), nincsenek ivarsejtek, csak Sertoli-sejtek (2. pont), és nincs szemcsés hám (1. pont).

Spermiumszám és mozgékonyság

A jobb cauda epididymisből 1,5 cm hosszú spermiumot kaptunk. A belső öblítést 1,0 ml módosított M199 táptalajjal végeztük 37 ° C-on, és a mintákat 30 percig inkubáltuk 37 ° C-os vízfürdőben rezgéssel a spermium úszásának előidézésére. Ezután egy 15 μl-es spermium-szuszpenziót extraháltak spermiumszámláláshoz és motilitási elemzéshez egy Hamilton-Thorne spermium-analizátor (HTM-IVOS) alkalmazásával. Ezután kiszámolták az egyoldali epididymis szuszpenziójában a spermiumok számát ml-ben.

A spermatogén sejt apoptózis értékelése

A TUNEL-módszert alkalmaztuk a fragmentált DNS 3'-végének jelölésére az apoptotikus spermatogén sejtekben. Az eljárást Roche TUNEL kémiai festési módszerével (Roche, SWISS, katalógusszám: 11684817910) hajtották végre [15]. A mikroszkóp alatt megfigyelt barnás-narancssárga részecskéket a sejtmagban apoptotikus sejtekként osztályozták. Az apoptózis indexet (AI) a következőképpen határoztuk meg: mindegyik szakaszból öt nagy teljesítményű mezőből 500 sejtet választottunk ki, és AI = apoptotikus sejtek száma/500 × 100%.

Antioxidáns státusz értékelése

A herék antioxidációs állapotának értékelésére szolgáló készleteket, beleértve a szuperoxid-diszmutáz (SOD) [16] és a malondialdehid (MDA) [17] koncentrációit, a Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute-tól (Nanjing, Kína) vásároltuk. A herék szöveteit elkülönítettük és folyékony nitrogénnel összetörtük, homogenizátumot készítettünk, és a fennmaradó eljárásokat a kit protokolljainak megfelelően hajtottuk végre.

Statisztikai analízis

A statisztikai elemzést az SPSS 13.0 szoftvercsomaggal (Chicago, IL, USA) végeztük. A diákok t-tesztjeit vagy Mann-Whitney tesztjeit használták az eredmények összehasonlítására a két csoport között. Az eredményeket átlag ± s.e.m. minden esetben, és P

Eredmények

Általános növekedési állapot és metabolikus paraméterek

Az eredmények azt mutatták, hogy a kontrollcsoportban lévőkhöz képest a táplálék-elhízási patkányok Lee-indexe és zsíregyütthatójának szintje jelentősen megnőtt (P 1. táblázat Általános növekedési állapot és metabolikus paraméterek

A spermiumok koncentrációja és mozgékonysága

Az elhízás spermiumok számára és életképességére gyakorolt ​​hatásának tisztázása érdekében a sperma koncentrációját és mozgékonyságát detektáltuk. Az epididymából kivont spermium koncentrációja 23,40 ± 9,72 × 106/ml és 24,64 ± 7,16 × 106/ml volt a két csoportban, szignifikáns különbség nélkül (P > 0,05). Amint az 1. ábrán látható, a spermiumok mozgékonysága [(36,40 ± 9,17)% vs (14,36 ± 7,67)%] szignifikánsan csökkent az elhízás csoportban a kontroll csoporthoz képest (P 1. ábra

elhízás

Szövettani vizsgálati eredmények

A spermatogenezis és a spermatogén sejtek morfológiájának értékelésére szövettani vizsgálatot végeztek. A HE-festés vakuolizációt mutatott a szemeszteres tubulusokban és strukturális diszfunkciót a spermatogén sejtekben vagy a csírasejtek leválását az alapmembránról az elhízás csoportjában (2a., B. Ábra). Nem találtunk szignifikáns különbséget a Johnsen-pontszámokban [(9,14 ± 0,14) vs (8,86 ± 0,09)] (P > 0,05) a két csoport között (2c. Ábra). Arra a következtetésre jutottunk, hogy az elhízás rövid távú hatása a herék működésére nem feltétlenül nyilvánvaló; a hosszú távú hatások azonban károsíthatják a spermatogén funkciót.

Az elhízás spermatogén sejt apoptózisra gyakorolt ​​hatásainak megfigyelésére TUNEL vizsgálatot végeztünk. A spermatogén sejtek AI-je (3a. Ábra, b) szignifikánsan megnőtt az elhízás csoportban a kontroll csoporthoz képest [(5,95 ± 0,49)% vs (8,61 ± 1,05)%] (P 3. ábra

Reproduktív hormon vizsgálatok

Az elhízás férfi reproduktív hormonokra gyakorolt ​​hatását tekintve a szérum cFT-koncentrációja csökkent, és a szérum SHBG-szintje emelkedett (P 2. táblázat A reproduktív hormon szintje a két csoportban

Oxidatív stressz értékelése

Az elhízás oxidatív stresszre gyakorolt ​​hatásának meghatározásához meghatároztuk az SOD és az MDA koncentrációit a here homogenizátumban. A herehomogenizátum SOD és MDA koncentrációja [(64,8 ± 10,2) vs (56,6 ± 14,4) U/ml] és [(3,0 ± 0,7) vs (4,0 ± 0,8) nmol/ml] volt a két csoportban (P > 0,05) és (P > 0,05), illetve (4. ábra). Az eredmények azt mutatták, hogy a SOD koncentráció csökkent, míg az MDA koncentráció növekedett; azonban egyik változás sem volt statisztikailag szignifikáns.

Vita

Az elhízás krónikus anyagcsere-betegség, amelyet különféle genetikai és környezeti tényezők kölcsönhatásai okoznak. Érdekes módon az elmúlt 50 évben, az emberi elhízás évről évre növekvő tendenciájával együtt, a termékenység párhuzamosan csökkenő tendenciát mutatott [18]. Számos tanulmány kimutatta, hogy a magasabb BMI a spermiumkoncentráció jelentős csökkenésével jár [19,20,21]. A nyomozók megkísérelték megvizsgálni az elhízás és a termékenység csökkenése közötti kapcsolatot; konszenzus azonban nem született.

Jelenleg nem áll rendelkezésre egységes standard az elhízott patkányok értékelésére. 1929-ben MO Lee [22] a Lee-indexet javasolta a patkányok elhízásának értékelésére, amely a leggyakrabban alkalmazott módszer az elhízott patkányok értékelésére. A diéta által kiváltott elhízási modellben, amelyet Levin jelentett, a patkányok elhízás-rezisztenssé váltak a magas zsírtartalmú étrend alkalmazásával [23], és különbségeket találtak energia-, endokrin, zsír- és glutaminsav (GLU) anyagcseréjükben. A vonatkozó szakirodalom és a Lee index alapján a magas zsírtartalmú étrendben lévő patkányok egynegyedét kizártuk tanulmányunkból, mivel elhízás-rezisztensek voltak. A patkányok fennmaradó háromnegyedét az elhízás csoportjába sorolták [24]. Eredményeink az elhízott patkány modell sikeres generálását igazolták.

Jelenleg a férfi elhízás spermaszámra, mozgékonyságra és morfológiára gyakorolt ​​hatása ellentmondásos. Egy áttekintés azt találta, hogy 2015-ig 35 cikkből 13-ban számoltak be fokozatosan csökkent mozgékonyságról, míg a normális morfológiájú spermiumszám csökkenéséről 29-ből csak 9-ben számoltak be [6]. Két nemrégiben készült metaanalízis, köztük 14 és 21 tanulmány, az azoospermia vagy az oligozoospermia fokozott kockázatát mutatta túlsúlyos vagy elhízott férfiaknál [25, 26]. Ennek a tanulmánynak az eredményei azt jelezték, hogy a zsírtartalmú étrend által kiváltott elhízás megváltoztathatja a szemfenék tubulusainak hisztomorfológiáját, amelynek ugyan nem lehet azonnal nyilvánvaló hatása a hím termékenységre, de az elhízás okozta spermatogenezisre gyakorolt ​​hosszú távú hatás károsíthatja a hím termékenységet.

A lakosság génpolimorfizmusai miatt gyakran figyelmen kívül hagynak számos olyan tényezőt (például dohányzás, alkoholfogyasztás és gyógyszeres kezelés), amelyek befolyásolhatják a szeminális paramétereket. Ezenkívül a mintaválasztási torzítás következetlen következtetésekhez vezethet az elhízás spermára gyakorolt ​​hatását illetően. Ez a tanulmány a különböző zavaró tényezők ellenőrzésével feltárta, hogy az elhízás csökkentette a spermiumok mozgékonyságát anélkül, hogy megváltoztatta volna a spermiumok számát, ami összhangban áll a korábbi jelentésekkel [25]. A lehetséges mechanizmus a spermasejtek membránjainak, a spermasejtek DNS-jének és a spermium mitokondriumainak károsodása lehet a túlzott reaktív oxigénfajok (ROS) által kiváltott [27, 28].

Az apoptózis egy autonóm programozott sejtpusztulási folyamat, amelyet meghatározott körülmények között stimulálnak és különféle gének szabályoznak. Megállapítottuk, hogy a spermatogén sejtek AI-je szignifikánsan növekedett az elhízás csoportban. Egy nemrégiben elvégzett tanulmány megállapította, hogy a herék spermatogén sejtjeinek apoptózisa a férfi szubfertilitás egyik fő oka [29]. A sejtek apoptózisát döntően a Bax és a Bcl-2 homeosztázisa szabályozza és szabályozza. Amikor a Bcl-2/Bax arány megszakad, a downstream kaszpáz jelátviteli utak aktiválódnak, ami apoptózist eredményez. A magas zsírtartalmú étrendről beszámoltak arról, hogy fokozza a Bax és a kaszpáz-3 expresszióját, de csökkenti a herékben a Bcl-2 expressziót [30]. Eredményeink alapján tehát az elhízott patkányok fokozott spermatogén sejt apoptózist mutattak ki a Bcl-2/Bax egyensúlyhiánya miatt. Az elhízás emellett lipid metabolikus rendellenességeket és hiperlipidémiát eredményezett, amelyek növelhetik az endoplazmatikus retikulum stresszreakcióját. Ezért a spermatogén sejt apoptózis előfordulása tovább növekszik [31, 32] a megnövekedett GRP78 mRNS és fehérje expresszió révén.

Az SHBG a tesztoszteron és az ösztradiol vérszállító fehérje. Szintézisét és szekrécióját az androgén és az ösztrogén szabályozza. A szérum SHBG közvetlen vagy közvetett hatást gyakorolhat az androgén-konverzióra és az anyagcserére, és szabályozza a GLU homeosztázisát és a zsírsav-anyagcserét. Ebben a kísérletben eredményeink megerősítették a szérum TT és cFT szintjének csökkenését és a szérum SHBG koncentrációjának növekedését elhízott patkányokban. Ezért feltételezzük, hogy a szérum SHBG a kulcsfontosságú tényező a szérum cFT-szintjének csökkentésében, és az elhízott patkányoknál enyhe primer hipogonadizmus alakulhat ki (csökkent szérum TT és cFT, megnövekedett SHBG). Az elhízott patkányok primer hipogonadizmusa valószínűleg a HPT-tengely változásainak elindító tényezője.

Az oxidatív stressz szoros összefüggésben áll a gyulladásos és anyagcsere-betegségek sokféleségével, beleértve az elhízást is. Az oxidatív stressz erősen korrelál a szabad gyökök által okozott kumulatív károsodásokkal, amelyeket az antioxidánsok nem megfelelő módon semlegesítenek, az oxidatív károsodást pedig súlyosbítja az antioxidáns enzimaktivitások csökkenése, például a SOD, a kataláz (CAT) és a glutation S-transzferáz aktivitása (GST) [38]. A bizonyítékok arra utalnak, hogy az elhízás számos oxidatív stresszforrást tartalmaz [39]. Vizsgálatunkban az elhízás oxidatív stresszre gyakorolt ​​hatásának meghatározásához meghatároztuk a SOD és az MDA koncentrációit a here homogenizátumban.

A SOD, amely megvédi a sejteket az ROS által okozott szabadgyökök okozta károsodásoktól, fontos enzim, amely megvédi a belső és külső szuperoxid-ionok által okozott sérüléseket. Az MDA a szabad gyökök által okozott lipidperoxidáció során keletkező aldehid. Az MDA jelzi a sejtmembrán károsodását, és tükrözi a reaktív sejteket érintő oxigéngyök támadásának súlyosságát és a szabad gyökök metabolizmusának szintjét in vivo. A csökkent SOD és a megnövekedett MDA oxidatív stresszt válthat ki, sejtkárosodást és akár halált is okozhat. Ez a tanulmány megállapította, hogy az elhízott patkányok csökkent SOD-szintet és megnövekedett MDA-szintet mutatnak a herék szöveteiben, bizonyítva, hogy az elhízott patkányokban a herék szöveteinek oxidatív stressz szintje megnövekedett, és befolyásolhatja a spermiumok mozgékonyságát. Számos lehetséges magyarázat magyarázhatja ezeket a megállapításokat: az elhízás a megemelkedett szérum szabad zsírsavakkal társul, a telítetlen zsírsavak pedig hajlamosak a ROS támadásaira, peroxidációt produkálva, majd csökkent SOD-szintet és MDA-felhalmozódást eredményeznek, amelyet végül a megnövekedett növekedés tükröz. oxidatív stressz szintje [40].

Következtetés

A magas zsírtartalmú étrend alkalmazásával elhízott patkányok lipidanyagcsere-rendellenességet és megváltozott reproduktív hormonszintet, valamint megnövekedett oxidatív stresszszintet mutattak a hereszövetekben, ami enyhe primer hipogonadizmushoz vezetett. Eközben a HPT tengely normál működését rövid távon fenntartják egy megfelelő visszacsatolási mechanizmus révén. Az elhízás hosszú távú hatásai azonban csökkenthetik a férfiak termékenységét.