Az ApoA-I (Lys107 → 0) alanyok az ApoA-I fokozott frakcionális katabolikus sebességét mutatják ki Lp-ben (AI) és ApoA-II-t Lp-ben (AI AII-vel)

A lipidmetabolizmus laboratóriumából és a tömegspektrometriás laboratóriumból, Jean Mayer USDA Humán Táplálkozási Kutatóközpont öregedésről a bostoni Tufts Egyetemen (Massachusetts) és a finn Helsinki Egyetemi Központi Kórházban (M.T.-K., R.M., M.-R.T.).

Absztrakt

Kimutatták, hogy számos apoA-I génmutáció kapcsolódik a HDL koleszterin és az apolipoprotein szint csökkenéséhez. 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Egyesek nagy deléciók és jelentős DNS-átrendeződések, mások pontszerű mutációk következményei. 10 11 12 13 14 15 16 17 18 A közelmúltban leírtunk egy finn törzset, amelynek 3 bp deléciója volt az apoA-I génben, amelynek eredményeként az érett apoA-I [apoA-I (Lys107 → 0)]. Az apoA-I-ben szenvedő betegek (Lys107 → 0) megkülönböztető jellemzői a plazma HDL-koleszterin és Lp (AI w AII) koncentrációjának csökkenése, de a normál Lp (AI) részecskekoncentrációk. 19.

Korábbi kinetikai vizsgálatok kimutatták, hogy az apoA-I plazma RT-je rövidebb, mint az apoA-II. 20 21 22 23 24 25 26 Rader és mtsai 26 arról számoltak be, hogy az apoA-I forgalmi sebessége Lp (AI) részecskékben gyorsabb, mint normál alanyokban az apoA-I Lp (AI w AII) részecskékben. Beszámoltak arról, hogy az apoA-I FCR az elsődleges faktor, amely szabályozza a plazma apoA-I szintjét. 22 25

Vizsgálatunk célja az apoA-I és az apoA-II in vivo metabolizmusának vizsgálata HDL részecskékben, Lp (AI) és Lp (AI w AII), az apoA-I heterozigóta egyedekben (Lys107 → 0) mutáció a kinetikus mechanizmus tisztázása érdekében, amely figyelembe veszi a csökkent Lp (AI w AII) szintet ezeknél a betegeknél.

Mód

Tanulmányi tárgyak

Legalább 3 héttel az anyagcsere-vizsgálatok előtt az alanyok izokalorikus természetes táplálékot kaptak, amely 36% zsírt (15% telített, 15% egyszeresen és 6% többszörösen telítetlen), 15% fehérjét és 49% szénhidrátot tartalmaz. körülbelül 150 mg/1000 kcal koleszterintartalom. A vizsgálati protokollt a Helsinki Egyetemi Központi Kórház Etikai Bizottsága, valamint a New England Medical Center és a Tufts University Humán Vizsgálati Bizottsága hagyta jóvá. Az összes résztvevő klinikai jellemzőit és plazma lipidértékeit az 1. táblázat tartalmazza .

Tanulmányi protokoll

Plazma lipoproteinek izolálása

A plazma lipoprotein-frakciókat szekvenciális ultracentrifugálással izoláltuk Beckman L8-70 ultracentrifugában (Beckman Instruments), Beckman 50TI rotorral, a korábban leírtak szerint. 28 VLDL-t, IDL-t, LDL-t és HDL-t izoláltunk 1,006, 1,019, 1,063 és 1,21 g/ml sűrűségben.

Lp (AI) és Lp (AI w AII) elválasztása

A deutérium dúsítás meghatározása

Az apoA-I és az apoA-II fehérje sávokat kivágtuk a poliakrilamid gélekből, és 12 N sósavoldatban 110 ° C hőmérsékleten 24 órán át hidrolizáltuk és nitrogénatmoszférában szárítottuk. A hidrolizátumokat átalakítottuk N-propil-észter és N-heptafluor-butiramid-származékokat és nitrogénatmoszférában szárítottuk, az előzőekben leírtak szerint. 31 Etil-acetátban végzett szuszpendálás után a tiszta felülúszót automatikus mintavevő fiolákba (Kimble) tettük. A deutérium plazmában való dúsulásának mérésére a fehérjék hidrolízise után a szabad aminosavakat Dowex AG-50W-X8 100-200 mesh kationcserélő gyantával (Bio-Rad) izoláltuk és átalakítottuk N-propil-észter és N-heptafluor-butamid-származékok a fentiek szerint. Valamennyi mintát 5985B gázkromatográf – tömegspektrométerrel (Hewlett Packard) elemeztük, negatív kémiai ionizációt és metánt használva reagensgázként.

Kinetikai adatok elemzése

Analitikai módszerek

A plazma és a lipoprotein frakciók koleszterin és triglicerid szintjét standardizált enzimatikus módszerekkel elemeztük. A HDL-koleszterin koncentrációt a plazmában mértük dextrán-szulfát – Mg 2+ kicsapási módszerrel. A plazma apoA-I és apoB koncentrációit nem versenyképes, enzimhez kapcsolt immunszorbens teszttel vizsgáltuk immuntisztított poliklonális antitestek alkalmazásával. 37 38 Az Lp (AI) koncentrációját a HDL szubfrakcióban 39-es immunelektroforézissel mértük, kereskedelemben kapható készletekkel, amelyek hidratált agarózgélekből és apoA-I-re és apoA-II-re (Sebia) monoszpecifikus antiszérumokból álltak. Az apoA-I koncentrációját Lp-ben (AI) és az apoA-II koncentrációját Lp-ben (AI w AII) a gyártó által megadott szabványok alapján határoztuk meg. Az apoA-I koncentrációját Lp (AI w AII) részecskékben úgy számítottuk ki, hogy az Lp (AI) koncentrációt levontuk az összes apoA-I plazmakoncentrációból, enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálattal elemezve. A lipidvizsgálatok variációs együtthatói a futáson belül és belül voltak 19, az átlagos HDL-koleszterin/(apoA-I + apoA-II) arány a betegeknél (0,19) szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a kontroll alanyoknál (0,32, P −1 · d −1), mint kontroll alanyoknál (2,49 ± 0,85 mg · kg −1 · d −1, P −1 · d −1) és kontroll alanyok (5,61 ± 1,74 mg · kg −1 · d −1, 5. táblázat). Az apoA-II átlagos APR-értéke a betegeknél (1,58 ± 0,59 mg · kg –1 · d –1) és a kontroll alanyokban (1,46 ± 0,65 mg · kg –1 · d −1) hasonló volt. Az apoAI APR aránya az Lp (AI) és az Lp (AI w AII) részecskékhez (APR arány) a betegek és a kontroll alanyok közötti leginkább megkülönböztető paraméter. A betegek átlagos APR aránya (1,29 ± 0,11) több mint kétszerese volt a kontrollalanyok APR arányának (0,46 ± 0,12) (P 40 A betegeknél az összes apoA-I APR-je magasabb volt, mint a kontroll alanyokban, az apoA-IIé pedig hasonló volt a kontroll alanyokhoz. Ezért az apoA-I (Lys107 → 0) heterozigóták csökkent plazma apoA-I és apoA-II koncentrációi nem következményei az apoA-I vagy apoA-II termelésének hibáinak, hanem a fokozott frakcionális katabolizmus következményei.

Az alacsony plazma HDL-koleszterinszint, valamint az apoA-I és az apoA-II in vivo metabolizmusa közötti összefüggést intenzíven tanulmányozták. Ginsberg és mtsai 55 magasabb apoA-I FCR-t találtak, de hasonló apoA-I termelési rátát mutattak izolált alacsony HDL-koleszterinszinttel vagy alacsony HDL-koleszterinnel rendelkező, magas plazma trigliceridkoncentrációval társult alanyokban, összehasonlítva a normolipidémiás alanyokkal. Hasonlóképpen, Gylling és mtsai 56 normális apoA-I termelési sebességről és az apoA-I plazma RT csökkenéséről számoltak be normolipidémiás betegeknél, csökkent HDL koleszterinszint mellett. Brinton és mtsai 57 fordított összefüggést mutattak ki a plazma HDL-koleszterinszint és az apoA-I és az apoA-II FCR között. Taskinen és mtsai 58, valamint Brinton és mtsai 25 kimutatták, hogy az Lp (AI w AII) részecskék plazmakoncentrációja elsősorban ezen részecskék szintézisének sebességétől függ. A korábbi megfigyelésekkel ellentétben az Lp (AI) szintézise fokozott, az Lp (AI w AII) szintézise normális az apoA-I-ben szenvedő betegeknél (Lys107 → 0).

Az apoA-I in vivo metabolizmusát radioaktív jódozott apoA-I alkalmazásával az apoA-I két mutáns formájában vizsgálták. Ezen apoA-I variánsok egyike, az apoA-IMilano, az apolipoprotein A-I első leírt variánsformája, amelyben a cisztein az érett apoA-I fehérje 173. aminosavánál helyettesített arginint. 10 ApoA-IMilano alanyra a csökkent HDL-koleszterin és az apoA-I szint jellemző. A másik apoA-I variáns, az apoA-IIowa, olyan változat, amelyben a glicin és az arginin közötti szubsztitúció az apoA-I 26. szekvenciájánál hypoalphalipoproteinemia és szisztémás amyloidosis társul. 11 ApoA-IMilano alanyokban a csökkent apoA-I koncentrációt Roma és munkatársai 59 kimutatták, hogy mind a kóros apoA-I, mind a normál apoA-I fokozott katabolizmusának a következménye, míg az összes apoA-I termelési ráta normális volt. Az apoA-IIowa alanyokban Rader és munkatársai 60 a radioaktívan jelölt apoA-IIowa megnövekedett clearance-arányáról számoltak be a kontrollal összehasonlítva. Az apo-IIowa-ban szenvedő betegeknél az apolipoprotein A-I termelési sebessége normális volt. Az apoA-II metabolizmusát nem vizsgálták sem apoA-IMilano, sem apoA-IIowa alanyokban.

Több mint 20 különböző apoA-I variánst írtak le, amelyeket az apoA-I gén pontmutációi, deléciói vagy átrendeződései okoztak. Ezen apoA-I variánsok egy része egyértelműen a plazma HDL-koleszterin és az apolipoprotein A-I koncentrációjának csökkenésével járt. Ennek a vizsgálatnak az eredményei azt mutatják, hogy az apoA-I és az apoA-II megnövekedett kiürülési sebessége, nem pedig a termelés csökkenése okozza az Lp (AI w AII) részecskék és a HDL-koleszterin szignifikánsan alacsonyabb szintjét az apoA- I (Lys107 → 0) variáns. A betegeknél az újonnan szintetizált apoA-I nagyobb arányban jut be a plazmába az Lp-n (AI) belül, mint az Lp-n (AI w AII), ami megmagyarázhatja a normális Lp (AI) szintet.