Az alacsony frekvenciájú elektromos stimuláció csillapítja az izomsorvadást a CKD-ben - egy lehetséges kezelési stratégia

Absztrakt

Az izomsorvadás a CKD egyik fő szövődménye, amely a túlzott morbiditással és mortalitással jár. 1,2 Számos kutató tanulmányozta az izomsorvadást, hogy megpróbálja megtalálni az optimális terápiát az izomsorvadás orvoslására az izomanabolizmus javításával. Azonban még mindig messze vagyunk attól, hogy megnyerjük a CKD vagy más anyagcsere-betegségek által kiváltott izomsorvadás elleni harcot.

Az izomveszteség megelőzésére vagy kezelésére szolgáló stratégiák a CKD-ben tartalmazzák a hidrogén-karbonát kezelés alkalmazását a metabolikus acidózis korrigálására, 3 anabolikus androgén szteroidok (tesztoszteron származékok), 4 peroxisome proliferátorral aktivált receptor gátlók (azaz roziglitazon) használatát az inzulinérzékenység növelése és az inzulin csökkentése érdekében rezisztencia, 5 és többek között myostatin inhibitor (peptitest) 6 vagy foszforilezett stat3 inhibitorok 7 biztosítása. A CKD által kiváltott izomsorvadásnak azonban nincsenek egyszerű és hatékony kezelései. Bebizonyosodott, hogy a testmozgás megakadályozhatja az izomvesztést a CKD egerekben 8 és a CKD-ben szenvedő betegeknél, 9.

Az akupunktúrát, mint terápiás beavatkozást széles körben használják az Egyesült Államokban és az egész világon. 10 A hagyományos kínai orvoslás az akupunktúrát biztonságos, nem gyógyszeres beavatkozásnak tekinti. 11,12 Tanulmányok azt mutatják, hogy az akupunktúrás kezelés enyhítheti az olyan tüneteket, mint a fáradtság, a stressz, a magas vérnyomás, a proteinuria és a viszketés a dialízis alatt álló ESRD-ben szenvedő betegeknél. Az akupunktúra kimutatta, hogy csökkenti az egerek hátsó végtag szuszpenziója által kiváltott vázizom atrófiát. 16 Elektromos akupunktúrás kezelésről kimutatták, hogy elnyomja a miosztatin expressziót, ami műholdas sejtekkel kapcsolatos proliferatív reakcióhoz és helyrehozáshoz vezet a vázizomzatban. 17 Az alacsony frekvenciájú elektromos stimuláció (LFES) egy akupunktúrás technika, amely az izomösszehúzódás stimulálásával megismétli az ellenállás gyakorlásának előnyeit.

A vázizomzatban az inzulin vagy az IGF-1 kritikus szerepet játszik a fehérje anyagcsere fenntartásában. Általában az inzulin és az IGF-1 jelátvitel szabályozása megakadályozza a CKD által kiváltott izomsorvadást. Az 5,8,18–20 IGF-1-et túlnyomórészt a máj állítja elő. A legújabb tanulmányok erősen feltételezik, hogy a makrofágok az IGF-1 fő extrahepatikus forrása, amely hozzájárul a posztnatális növekedés és a szervi érés szabályozásához. 21

A gyilkos vagy a javító fenotípust expresszáló makrofágokat ma főként M1 vagy M2 makrofágoknak nevezik. 22 Az M1 és M2 makrofágok eltérő kemokin és kemokin receptor profilokkal rendelkeznek. Az M1 gyilkos makrofágokat proinflammatorikus citokinek, például IFN-y aktiválják. Az M1 markerek közé tartozik az IL-1β és az indukálható nitrogén-monoxid szintáz. Ezzel szemben az M2 javító makrofágok konstruktív folyamatokban működnek, például a sebgyógyulásban és a szövetek helyreállításában, gyulladásgátló mediátorok, például argináz-1 és IL-10 előállításával, amelyeket markerekként használnak az M2 makrofágokhoz. 23 A makrofágok általában hiányoznak, vagy nagyon alacsony az izomzat, és általában az M2 fenotípusú.

A CKD által kiváltott izomsorvadás ésszerű terápiás megközelítésének megtervezéséhez ebben a tanulmányban azt vizsgáltuk, hogy az LFES befolyásolja-e az IGF-1 jelátviteli utat. Feltételeztük, hogy az LFES szabályozza az izomfehérje szintézisét és a fehérje lebontását a CKD egerek izmaiban. Ezenkívül itt beszámolunk az eredeti munka kiterjesztéséről, amely azt vizsgálta, hogy az LFES a gyulladásra és a makrofágok felhalmozódására gyakorolt hatásokon keresztül hat-e, amelyek viszont szabályozzák az IGF-1 jelátvitelt. Végül értékeltük az LFES izom-specifikus mikroRNS-ekre (myomiR-ekre) gyakorolt hatását, mint lehetséges terápiás lehetőséget.

Eredmények

Az LFES megakadályozza a CKD által kiváltott izomsorvadást és javítja az izomfogás működését

Az egereket (C57BL/6J; hím; 8 hetes korosztály) véletlenszerűen négy csoportba soroltuk: színlelt, színlelt/LFES, CKD és CKD/LFES (n = 12/csoport). CKD egerekben a BUN értékek 3,4-szer magasabbak voltak, mint a színlelten működtetett páros táplálású kontroll egerek (P Tekintse meg ezt a táblázatot:

Soron belüli megtekintése
Felugró ablak megtekintése

Izom és testtömeg

Az LFES növelte az izmok tapadásának erősségét

Az LFES javítja az izomfehérje anyagcserét

A p-Akt a CKD csoportban 29% -kal csökkent a színlelt értékhez képest. Ezt az alacsonyabb szintet azonban az LFES megfordította (1A. Ábra). Az LFES megakadályozta a CKD által kiváltott FoxO-1 (aktív forma) növekedését és a p-FoxO csökkenését (p-FoxO-Thr32; inaktív forma). A Foxo3a változatlan volt CKD egerekben (1A. Ábra). Annak igazolására, hogy az LFES megakadályozza az izomfehérje katabolizmust, aktin hasadást mértünk. A CKD 4,1-szeresére növelte a 14 kD aktin fragmenseket; Az LFES megakadályozta a CKD által kiváltott aktin lebontást (1B. Ábra). Ezután a fehérjeszintézis markereit vizsgáltuk. Az emlős rapamicin célpontjának (mTOR) foszforilációja szignifikánsan csökkent a CKD egerek izomzatában, szemben a színlelt egerekkel. Az LFES megfordította a p-mTOR szuppresszióját, aminek eredményeként a p-mTOR szintje kétszer magasabb volt a CKD/LFES csoportban, mint a CKD csoportban. Az LFES megakadályozta a CKD által kiváltott p-p70S6K depressziót is (1C. Ábra). Ezek az adatok azt jelezték, hogy az LFES fokozza az izomfehérje szintézist és csökkenti a CKD által kiváltott izomfehérje katabolizmust.

Az LFES megváltoztatja a myomiRs kifejezést. A teljes RNS-t izoláltuk a kontroll és az LFES egerek kombinált gastrocnemius és extensor digitorum longus izmaiból, majd megvizsgáltuk myomiRs expresszióját. A miR-1 (□), miR-206 (X) és miR-133a (A) expressziót az (Ctrl) előtt és naponta az LFES után mértük qPCR-sel, LNA-val fokozott oligonukleotid primerekkel. A grafikon a myomiRs expressziót mutatja LFES-kezelt egerekben a kontrollok többszörös változásaként kifejezve (LFES nélkül; 1-szeresre állítva). Az x tengely az LFES utáni időt mutatja, a 0. nap pedig közvetlenül az LFES után. Az eredményeket U6 RNS-re normalizáltuk (n = 9 pár). LNA, zárolt nukleinsav. # P 5,24–26 Ebben a tanulmányban azt tapasztaltuk, hogy az LFES felregulálja a helyi IGF-1-et, és ezáltal eszközt nyújt az izomtömeg és a funkció növelésére. Négyféle bizonyíték támasztja alá ezt a következtetést. Először is, az IGF-1 és az MGF lényegesen megnövekszik az LFES-sel kezelt egerek izomzatában (3. ábra). Másodszor, az LFES megakadályozza a CKD által kiváltott fehérje katabolizmus növekedését (1. ábra, A és B ábra). Harmadszor, az LFES megakadályozza az izomfehérje szintézis markerek CKD által kiváltott csökkenését (1C. Ábra). Negyedszer, az LFES stimulálja az izomregenerációs biomarkerek termelését és növeli a műholdas sejtek migrációját (2. ábra). A tényleges fehérjeszintézist és a teljes fehérje katabolizmust azonban ebben a vizsgálatban nem mérték.

Két mechanizmus létezik, amelyek révén az LFES szabályozza az IGF-1-et. Az LFES átmeneti gyulladásos választ okoz, amelyet az IL-6 és az IFN-y magas szintje jelez, és a myomiR-ek átmeneti csökkenését okozza, ami megnövekedett IGF-1-t eredményez.

Megállapítottuk, hogy az LFES átmeneti akut gyulladásos jelenséget okoz, amelyet egy élesen megnövekedett IL-6 és IFN-y mRNS mutat közvetlenül az LFES után. Ezek a szintek az első 24 órában csökkennek, és 48 órán belül visszatérnek a normális szintre. A gyulladás gyakori fiziológiai válasz a testmozgásra, és megnövekedett izomtömeghez vezet. 27 IL-6 knockout egérről kimutatták, hogy a túlterhelésre a hipertrófiás válasz károsodott. Korábban beszámoltunk arról, hogy az izomkárosodásra adott myogenesis válasz tompa volt az IL-6 knockout egerekben, 29 ami bizonyította az IL-6 pozitív hatását a myogenezisre. Más csoportok arról is beszámoltak, hogy az elektromos stimuláció növeli az IL-6 értéket mind a tenyésztett C2C12 sejtekben 30, mind az emberi primer izomsejtekben. 31,32 CKD-s betegeknél Caglar et al. 33 azt találta, hogy az IL-6 koncentráció növekedése szerény mértékű volt a hemodialízis során (14%), de a szintek drámai módon emelkedtek a 2 órás posthemodialízis periódus végén (68% -kal magasabbak a kiindulási értékhez képest).

Az LFES utánozza az ellenállást. A testmozgás részben a makrofágok aktiválásával növeli az izomtömeget. 34,35 A makrofág válaszban részt vevő makrofág típusa függ a működésüktől. Az M1 gyilkos makrofágok részt vesznek a fagocitózisban, vagy megfelelnek a mikrobáknak, ami tartós gyulladáshoz vezet. A többi M2 javító makrofág szorosabban illeszkedik a javítási funkciókhoz, és általában korlátozza vagy visszafordítja a gyulladást. Megállapítottuk, hogy az M1 marker, az IL-1β mRNS 24 óra alatt megnövekszik, és a 3. napon csökken az LFES után. Az argináz-1 M2 marker a 2. napon megemelkedik, és a 3. napon magas szinten marad az LFES után. Az argináz-1 magas szintjének időbeli lefutása párhuzamos volt a magas IGF-1 szint időbeli lefutásával, arra késztetve bennünket, hogy feltételezzük, hogy az M2 makrofágok felhalmozódása az IGF-1 felülszabályozásához vezet.

Az IGF-1-et túlnyomórészt a máj állítja elő. Számos tanulmány határozottan azt sugallja, hogy a makrofágok az IGF-1 fő extrahepatikus forrása. 21,36–38 Egy állatsérülési modellben Lu és mtsai. 36 megállapította, hogy a Ly-6C (-) altípus makrofágjai felhalmozódtak a sérült izomzatban, és magas szintű IGF-1-t produkáltak az izomregeneráció elősegítése érdekében. Egy humán vizsgálatban az IGF-1 szerepet játszik az idiopátiás tüdőfibrózis patogenezisében, és az intersticiális makrofágokat azonosítják az IGF-1 forrásaként. Vizsgálatunk során azt tapasztaltuk, hogy az IGF-1 és az MGF az izomban megnövekedett az LFES által, de a keringésben (szérumban) nem. Azt is megállapítottuk, hogy az LFES-sel kezelt izomban megnőtt a makrofágok száma, és hogy az IGF-1-gyel kolokalizált M2 makrofágok jelezték, hogy az IGF-1-et az M2 makrofágok lokálisan termelik.

Az IL-6 hatása az IGF-1-re ellentmondásos. Számos tanulmány, beleértve a csoportunk által végzett vizsgálatokat is, azt találta, hogy az IL-6 negatívan szabályozza az izomfehérje-anyagcserét az IGF-1 csökkentésével. 39 Raj és mtsai. 40 azt mutatta, hogy az IL-6 szint emelkedett az izomfehérje katabolizmusa alatt hemodialízisben szenvedő betegeknél. Ebben a tanulmányban azt találtuk, hogy az IL-6 átmenetileg megnövekedett az LFES után. Ez az IL-6 növekedés megkönnyítheti az M2 makrofágok helyi beszivárgását, amelyek gyulladásgátló citokineket termelnek, amelyek viszont a helyi szinten termelt IGF-1-et szabályozzák. Az IL-6 tartós növekedése hosszú távon következetesen az M1 makrofágokat indukálná gyulladásos citokinek termeléséhez, ami az IGF-1 jelátvitel csökkenõ szabályozásához és az izomfehérje lebontásának fokozásához vezetne. Az IL-6 növekedése azonban átmeneti volt, ami csak az M2 makrofágok kedvező toborzását eredményezte.

A miR-ek felfedezése bővítette ismereteinket a vázizom anyagcseréjének és működésének szabályozásáról. a myomiR-ek, például a miR-1 és a miR-206, általában az IGF-1 szint csökkenését okozzák. A miR-1 és a miR-206 egyaránt az IGF-1 3 'transzlálatlan régióját célozza meg és gátolja annak transzlációját, ami az IGF-1 fehérje mennyiségének csökkenéséhez vezet. 41,42 Ez a tanulmány azt mutatja, hogy ez a két myomiR csökkent a CKD egerek izomzatában az LFES után a korai időszakban, ami a makrofágok által közvetített stimulációval együtt hozzájárulhat az IGF-1 upregulációjához.

Azt is tapasztaltuk, hogy a miR-1 és a miR-206 az LFES utáni későbbi fázisban megnő. A myomiR-ekről számoltak be, hogy több szerepet játszanak az izomnövekedés és a vázizom differenciálódásának szabályozásában. A miR-1 és a miR-206 egyaránt közvetlenül célozza meg a Pax3-at és a Pax7-et, és meggyújtja a myogén programot. Vizsgálatunk kimutatta, hogy az LFES növelte a miR-1 és a miR-206 szintet, és a CKD egerek izomzatában tartósan magas szinten maradt, ami összefüggésben lehet a megnövekedett myogenezissel. Az LFES myomiR-ekre gyakorolt hatásának részleteiről azonban további tanulmányokra van szükség. A jövőbeli kutatások további érdekes témája, hogy a myomiR-ek változását a gyulladásos citokinek szabályozzák-e.

Összefoglalva, az LFES enyhítette a CKD által kiváltott vázizom atrófiát az izomfehérje metabolikus állapotának és az izomregenerációs képességének javulásával, ami megnövekedett izomtömeghez és funkcióhoz vezet. Mind a fokozott fehérjebontás, mind a myogenezis az inzulin/IGF-1 jelátviteli út javításának eredménye. Ebben a tanulmányban bizonyítékokat szolgáltattunk, amelyek arra utalnak, hogy az LFES két lehetséges mechanizmus révén javítja az izomfehérje anyagcserét és a myogenezist az IGF-1 növelésével: (1) a myomiR-ek csökkenése a korai válaszfázisban és (2) az M2 makrofágok felhalmozódása a későbbi válaszban fázis.

Tömör módszerek

Állatok és CKD-modell

A CKD állatmodellt és az LFES kísérleteket az Emory Egyetem Intézményi Állatgondozási és Felhasználási Bizottsága hagyta jóvá. A CKD-t 5/6 nephrectomia indukálta. Kezdetben az egereket párosítottuk súly-egyeztetett színlettel vagy egy CKD egérrel, 14% fehérje chow-val 1 hétig, majd további egy hétig magas fehérjetartalmú étrenddel (40% fehérje). A BUN-t a BUN kinetikus eljáráskészlettel (Thermo Electron, Louisville, CO) mértük a NADH NAD-dá történő átalakulásának sebességét, amelyet 340 nm-en figyeltünk meg.

Az izomfunkciót kettős számítógépes szenzorral ellátott egérfogás-erősségmérővel mértük meg a tapadási erő detektálására és rögzítésére (Columbus Instruments, Columbus, OH). Az egereknek hagyták, hogy az erőátalakítóval összekötött rácsot megfogják, és 5 másodpercig óvatosan húzzák a faroknál. A számítógépes érzékelők meghatározzák, hogy milyen erőre volt szükség az egerek fogásának ellensúlyozásához. Az egereket a CKD műtét előtt (kiindulási állapot), valamint az LFES előtt és után teszteltük. Minden egér tapadási erejét minden teszt alkalmával ötször teszteltük, az egyes tesztek között 10 perc pihenőt tartva. Az öt meghatározás átlagát jelentették.

LFES kezelés

Az egereket érzéstelenítés nélkül, speciálisan kialakított rögzítésben tartották, hogy az LFES kezelés alatt fekvő helyzetben maradjanak. A kiválasztott akupunktúrás pontok az Egészségügyi Világszervezet standard Akupunktúrás Nómenklatúrája szerint történtek. 45,46 A pozitív pont (GB34, Yang Ling Quan) a fibula elülső feje alatt van, körülbelül 6 mm-re (20 g-os egér) a felületes fibulus idegtől és a mély fibulus idegtől. A negatív pont (ST36, Zu San Li) a térdízületen kívül esik a fibula feje alatt, körülbelül 7 mm-re a fibulus idegtől. A tűket állandó impulzus, 20 Hz-es elektromos frekvencia és 1 mA-es elektromos áram segítségével SDZ-II elektronikus akupunktúrás eszközbe csatlakoztattuk. Az LFES-t minden nap 15 percig adtuk be a második nephrectomia után 15 napig. 0,25 mm átmérőjű eldobható steril tűket (Shen Li Medical & Health Material Co., Ltd., Wujiang, Kína) használtunk.

Western blot és antitestek

A hátsó végtag izmait Gentle Lysis Bufferben homogenizáltuk. 47 A fehérjéket Western blot analízisnek vetették alá korábban publikált módszerekkel. 19 általunk használt primer antitest (1: 1000 hígítás, kivéve ahol azt jeleztük) az Akt/p-Akt (Ser473), FoxO1/p-FoxO1 (Thr32), FoxO3/p-FoxO3 (Thr32), mTOR/p-mTOR (Ser2448) ) és 70S6K/p-p70S6K (Thr389), és a Cell Signaling Technology cégtől származnak. A MyoD, a Myogenin és az eMyHC a DSHB Product cégtől származik (University of Iowa, Lows, IA). A pTEN (FL-403) a Santa Cruz Biotechnology-tól (Santa Cruz, Kalifornia) származott; A glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz az EMD Millipore (Burlington, MA) cégtől származik. A fehérjetsávokat a Li-Cor Odyssey infravörös letapogató rendszer (Li-COR Biosciences, Lincoln, NE) segítségével szkenneltük és számszerűsítettük.

Izom immunohisztológia

Az izmokat TBS Tissue Freezing Media (Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) alá helyeztük szárazjégben hűtött izopentánban. Az izmok keresztmetszeteinek immunohisztológiai módszerét korábban leírták. 48 Izmonként legalább 500 egyedi miofiber pozitív sejtszámát a Micro-Suite Five Biologic Software (Olympus, Melville, NY) alkalmazásával mértük.

Antitesthasználat

Az Anti-F4/80 az Abcam, Inc. (Cambridge, MA) cégtől származik; az anti-Mac-2 és az anti-argináz-1 a Santa Cruz Biotechnology cégtől származik. A poliklonális anti-laminin antitest (1:50 hígítás; L9393; Sigma-Aldrich) és a kecske anti-egér IGF-1 a Lifespan Bioscience-től (Seattle, WA) származott.

Az egér IGF-1 mennyiségi mérése a szérum- és izomlízisben

Az IGF-1 egér ELISA készletet (ab100695) az Abcam, Inc. gyártotta és a gyártó utasításai szerint használták fel.

Fordított átírás és qPCR

A teljes RNS-t Tri-Reagens (Molecular Research Inc., Cincinnati, OH) alkalmazásával extraháltuk. Az RNS-t reverz transzkripciónak és qPCR-nek vetettük alá, korábban publikált módszerekkel. 47 primert terveztek az intron – exon határok átlépésére, a 3. táblázatban leírtak szerint. A myomiR-ek esetében a miRCURY LNA Universal cDNS szintézis készletet (Exiqon Inc., Woburn, MA) használtuk az RNS reverz transzkripciójához. Az alapozókat az Exiqon Inc. tervezte. A miRCUTY LNA mikroRNS PCR SYBR Green Master Mix-et (Exiqon Inc.) használtuk a qPCR-hez a következő ciklusparaméterekkel: 95 ° C 10 percig és 45 ciklus 95 ° C-on 10 másodpercig, és 60 ° C-on 60 másodpercig. Az egyes myomiR-ek expresszióját az egér U6 génjére standardizáltuk, és a két gén küszöbértékei közötti különbségként (ΔΔcq) számítottuk ki.

Statisztikai elemzések

Az adatokat átlag ± SEM-ként adtuk meg. Két csoport közötti szignifikáns különbségek azonosítása érdekében összehasonlításokat végeztek a t teszt alkalmazásával. Több kezelés összehasonlításakor ANOVA-t hajtottak végre. Különbségek a P értékekkel Griffiths RD

: Izomtömeg, túlélés és idős ICU-beteg. Nutrition 12: 456–458, 1996, pmid: 8875547