A Vibrio cholerae vasfelvétel szabályozójának feltérképezése kibővíti ismert génszabályozási hálózatát

Közreműködött: Mekalanos János J., 2011. június 12. (felülvizsgálatra elküldve: 2011. április 4.)

cholerae

Absztrakt

A ChIP és a következő generációs szekvenálás (ChIP-seq) párosítva forradalmasította a DNS-kötő fehérjehelyek teljes genomban történő feltérképezését. Bár a ChIP-seq gyorsan támogatást nyert az eukarióta rendszerekben, továbbra is alul használják a baktériumok transzkripciós szabályozó kötőhelyeinek feltérképezésében. A virulenciához szükséges vasra reagáló ferri felvétel szabályozó (Fur) alkalmazásával egyszerű, széles körben alkalmazható ChIP-seq módszerről számolunk be a Vibrio cholerae kórokozóban. A ChIP-seq eredményeinket a rendelkezésre álló mikroarray adatokkal ötvözve tisztázzuk az ismert vasra reagáló gének közvetlen és közvetett szőrme-szabályozását. A szőrme-kötő helyek egy részét in vivo validáljuk, és az összes Fur ChIP-seq csúcsban jelen lévő közös motívumot mutatjuk, amely fokozott kötési affinitást mutat a tisztított V. cholerae szőrméhez. További elemzés azt mutatja, hogy az V. cholerae Fur közvetlenül szabályoz számos további, a Fur-kötő helyhez kapcsolódó gént, kiterjesztve ennek a transzkripciós faktornak a riboszóma képződésének szabályozását, további transzport funkciókat és egyedi sRNS-eket.

A transzkripciós szabályozók kritikus szerepet játszanak a sejtes válaszokban azáltal, hogy megváltoztatják a gén-expressziós mintázatokat, amelyek végül proteomikus és fenotípusos változásokhoz vezetnek. Azok a baktériumok expressziós profilját, amelyek nem rendelkeznek transzkripciós szabályozókkal, sikeresen alkalmazták a törölt szabályozó által érintett gének tág meghatározására (1–4). Habár informatív adatokat szolgáltat, a transzkripciós elemzés önmagában nem képes megkülönböztetni a közvetlen és a közvetett szabályozó hatásokat, vagy azonosítani azokat a szabályozott géneket, amelyek transzkripciós szempontból némaak lehetnek a vizsgálati körülmények között. A transzkripciós szabályozóval vezérelt gének felkutatásának legközvetlenebb módja a ChIP, amelyet a kicsapódott szabályozóval társított DNS-fragmensek szekvenciaazonosítása követ (áttekintve az 5. hivatkozásban). A ChIP összekapcsolása a mikroarray technológiával (ChIP-ChIP) biztosította az első adatokat a genom egészére kiterjedő transzkripciós faktor kötődési helyekről mind a prokarióta, mind az eukarióta rendszerekben (áttekintve a 6. és 7. hivatkozásban). A legújabb technológiai fejlődés lehetővé tette a ChIP összekapcsolását a következő generációs szekvenálással (ChIP-seq), amely nagyobb lefedettséget, nagyobb felbontást és kevesebb zajt kínál, és kevesebb mintát igényel, mint a ChIP-ChIP (8).

2007-es bevezetése után a ChIP-seq-et gyorsan befogadták az eukarióta transzkripciós faktorok elemzése céljából (áttekintve a 8. hivatkozásban), de még nem használták fel jelentősen a baktériumok transzkripciós szabályozóinak tanulmányozására. Tudomásunk szerint csak két, ChIP-seq baktériumokon végzett vizsgálatot tettek közzé, amelyek a kromatint átalakító HN-S és Fis fehérjék feltérképezéséről számoltak be Escherichia coliban (9) és a DosR transzkripciós szabályozóról Mycobacterium tuberculosisban (10). Ez a tanulmányhiány tükrözheti a ChIP-minőségű antitestek hiányát a baktériumok fehérjéinél (11) vagy az érdeklődő szabályozó szuboptimális expresszióját laboratóriumi körülmények között.

A bakteriális vasfelvétel-szabályozó (szőrme) fehérje számos baktériumban szabályozza a vas transzportját és a homeosztázist (áttekintve a 12–14. Hivatkozásban). A vas szükséges az enzimatikus funkciókhoz; a szabad vas feleslege azonban káros lehet az oxidatív károsodás növelésével (15). Fe 2+ -hoz kötődve a szőrme specifikus DNS-helyekhez, úgynevezett „prémes dobozokhoz” kötődik, amelyek a célgének promóter-régiójában vagy annak közelében helyezkednek el, blokkolva az RNS-polimerázhoz való hozzáférést és elnyomva a génexpressziót.

A prémes doboz leírása és a szőrmével való összefüggése összetett (16. és 17. hivatkozás, áttekintve a 13. és 18. hivatkozásban). A prémes dobozt először E. coliban írták le 19 bp-os palindróm szekvenciaként, amely egy szőrme-dimert tartalmaz (19); az E. coli egyes prémmegkötő helyei azonban a 19 előre jelzett konszenzusbázis közül csak 11-nek felelnek meg. A prémes dobozokat más baktériumok, köztük a Vibrio cholerae esetében jósolták, a szőrme által szabályozott gének 5 ′ UTR-jének motívum-összehangolása alapján (20). A Fur számos DNS-kötési jellemzője nem magyarázható egyszerű palindrom szekvenciával. A lábnyomtatási kísérletek azt mutatják, hogy a szőrme a szőrme dobozánál lényegesen nagyobb régiót véd, ami arra utal, hogy kölcsönhatásba lép a DNS-rel az előre jelzett régión kívül. Ezenkívül több szőrme-dimer polimerizálódhat, és körbetekerheti a DNS-t olyan régiókba, amelyek nem rendelkeznek megfelelő Fur Box-konszenzus szekvenciákkal (21, 22). Ezen és más jelenségek magyarázatának elősegítése érdekében alternatív Fur boxokat javasoltak, köztük egy szekvenciát, amely három 6 bp ismétlést (23) és átfedő 13 bp 7-1-7 motívumot tartalmaz (24).

A vcFur regulon teljesebb meghatározása érdekében bemutatunk egy egyszerű, széles körben alkalmazható platformot a transzkripciós faktor-kötő helyek feltérképezésére V. cholerae-ban ChIP-seq alkalmazásával. Összehasonlítottuk a prémmutánsok rendelkezésre álló transzkripciós válaszait a genomi kötési hely adatainkkal, hogy azonosítsuk a vcFur közvetlen és közvetett szabályozási célpontjait, valamint további kötési helyeket. Eredményeink biztosítják a korábbi közvetlen vcFur szabályozási jóslatok biokémiai validálását, meghatároznak egy vcFur boxot, amely fokozottan kötődik a vcFur-hoz, és milyen következményei vannak a vcFur-DNS kötődésre, és meghatározzuk a vcFur további szerepeit a riboszóma képződésének, a transzport funkcióinak és az sRNS-eknek a szabályozásában. Eredményeink validálják ennek a ChIP-seq módszernek a felhasználását a baktériumok transzkripciós szabályozói számára, támogatást nyújtanak a transzkripció szabályozó kötőhely információinak és a rendelkezésre álló expressziós elemzésnek a kombinálásához, és jelentősen kibővítik ennek a szinte mindenütt jelenlévő baktérium transzkripciós szabályozónak a hálózatát.

Eredmények

A ChIP-Seq azonosítja a közvetlen és közvetett célokat a vcFur által szabályozott gének között.

Kimutatták, hogy a különféle gének szőrfüggő szabályozása növekedési fázistól és állapottól függően változik (26–28). A vcFur fehérje szintje megháromszorozódik az állófázisba kerülve (25), ami potenciálisan megváltoztathatja a DNS-kötő célpontok spektrumát. Feltételeztük, hogy a magasabb vcFur-szint jobban feltárja a genomi kötőhelyek teljes spektrumát.

Ismert vcFur-szabályozott gének társulnak a vcFur ChIP-csúcsokkal

A ChIP-Seq elemzés kibővíti a vcFur-kötő webhelyek számát.

További 34 gc/sRNS-hez társított vcFur ChIP-csúcsot azonosítottunk (2. táblázat). Nagyjából kategorizáltuk ezeket a géneket a transzportra, a transzkripciós és transzlációs szabályozásra, a mozgékonyságra, a közvetítő anyagcserére és a hipotetikus ORF-ekre. Négy vcFur ChIP csúcs fedte át több, szorosan szomszédos gén start kodonját. A vcFur kontrollra utaló expressziós adatok hiánya kizárta a csúcsok azonnali társulását egyetlen ORF-mel.

Új vcFur ChIP csúcshoz kapcsolódó ORF-ek és sRNS-ek

A vcFur ezekhez a lokuszokhoz való kötődésének validálásához új csúcshelyek egy részhalmazát választottuk, és kvantitatív PCR-t (qPCR) használtunk annak meghatározására, hogy ezek a genomi lokuszok hányszorosan gazdagodnak-e vcFur ChIP mintáinkban, összehasonlítva a pre-ChIP kontroll DNS-sel (3. táblázat). Referenciaként meghatároztuk a vcFur kötődés dúsulását az ismert szabályozó célpontok előtt az enterobaktin receptor A gén (irgA) és a tonB1, valamint két nem célzott genomi lokusz [IV endonukleáz (nfo) és izocitrát dehidrogenáz (icd)] negatív kontrollként. A ChIP-seq által azonosított hét új vcFur-csúcs szeres dúsításának mennyiségi meghatározása egyenértékű vagy nagyobb dúsulást mutatott, mint az irgA és a tonB1 promoter régiókhoz való kötődés. Ezek az eredmények alátámasztják ChIP-csúcsainkat, amelyek hiteles vcFur-kötő helyeket tartalmaznak. Meglepő módon ebből a hét vcFur-kötő helyből hat nagyobb dúsulást mutatott ChIP, mint az ismert vcFur-szabályozott tonB1 gén promoter. Ezenfelül e vcFur-kötő helyek közül kettő nagyobb dúsulást mutatott ChIP-vel, mint az irgA promóter régió. Külön említést érdemel egy vcFur-kötő hely egy alternatív riboszomális fehérje, a VC0878 előtt, amely ~ 300-szoros dúsulást mutatott.

A vcFur új genomi lokuszokhoz való kötődésének validálása

A ChIP-Seq elemzés meghatározza a fokozott V. cholerae szőrme dobozát.

A vcFur ChIP Fur doboz szigorúbb követelményeket támasztott a szermaradványok helyzetére, mint a vcFur box, amelyeket a mikroarray vizsgálatok jósoltak. Összehasonlítottuk a tisztított vcFur kötődését a mikroarray- és ChIP-seq-definiált vcFur dobozokhoz és egy kontroll polyA/T DNS duplexhez. Zn 2+ -val rekonstruált vcFur-t használtunk, mert ez az ion szükséges a vcFur szerkezetéhez, nem gyorsan oxidálódik, és lehetővé teszi, hogy a vcFur ugyanolyan hatékonyan kötődjön ismert promóterekhez, mint a Fe 2+ -ot tartalmazó vcFur (38). A tisztított vcFur a mikroarray- és a ChIP-seq-definiált vcFur dobozokat egyaránt megkötötte, de a kontroll duplexet nem kötötte meg (1C. Ábra). Érdekes, hogy a vcFur 3,1 ± 1,1-szer erősebben kötötte meg a ChIP által definiált vcFur boxot, mint a korábban megjósolt vcFur doboz (1C. Ábra). Ennek a konszenzusnak a Fur box azonosítása az összes ChIP-csúcsban tovább alátámasztja e genomi régiók érvényességét valódi vcFur-kötő helyekként.

A ChIP-Seq által azonosított kötőhelyek kibővítik a vcFur által szabályozott gének és sRNS-ek készletét.

Az új vcFur ChIP csúcsokkal társított gének vcFur-függő szabályozása

Vita

Számítási módszerekkel sikeresen megjósolták a vcFur-kötő helyeket az V. cholerae genomban (42, 43). Ugyanakkor egyetlen számítógépes tanulmány sem volt képes megjósolni a ChIP-seq elemzésünkben azonosított vcFur-kötő helyek spektrumát. Igazság szerint a bioinformatikai algoritmusoknak a jelenleg rendelkezésre álló, esetleg hiányos kísérleti adatokra kell támaszkodniuk a keresési motívumok levezetéséhez. Érdekes lesz meghatározni, hogy a vcFur-kötő helyek kibővített halmaza hogyan befolyásolja a Fur-kötő helyek számítási előrejelzéseit.

A ChIP-seq elemzést és a rendelkezésre álló expressziós adatokat kombinálva egyértelműen megkülönböztethetjük a közvetlen és a közvetett vcFur szabályozást, és most sokkal szélesebb szerepet javasolunk a vcFur számára a közvetlen szabályozásban. Elemzésünk nagymértékben kibővíti a kísérletileg igazolt vcFur-kötő helyek számát, és további több gént feltételez, hogy közvetlen vcFur-szabályozás alatt állnak. Számos oka lehet annak, hogy a vcFur-kötő helyeinkhez kapcsolódó géneket nem azonosították a mikroarray vizsgálatokban. Az olyan célpontok, mint az sRNS-ek és a kicsi ORF-ek, mint például a VC0878, nem szerepeltek a mikroarrayben, és ezért nem lettek volna tesztelve. Egy fur: Tn mutánsban qPCR eredményeink több mint 200-szorosára mutatták az irgA felső szabályozását (4. táblázat). A qPCR segítségével megmutattuk, hogy az új vcFur-kötő helyekhez kapcsolódó három gén is fel van szabályozva egy szőr: Tn mutánsban, de sokkal kisebb mértékben, mint az irgA (4. táblázat). A microarray elemzés érzékenysége nem biztos, hogy elég magas volt ahhoz, hogy kimutassa ezeket a viszonylag kicsi változásokat a génexpresszióban, vagy ezek a viszonylag kis változások nem reprodukálhatók a kísérletek között.

Eredményeink azt mutatják, hogy a promóter régióban a vcFur magas szintű kötődése nem korrelál közvetlenül a társított gén magas szintű szabályozásával (2. és 3. táblázat). A vcFur-kötő hely kontextusa ugyanolyan fontos lehet, vagy annál fontosabb, mint a vcFur affinitása a helyhez. Más transzkripciós faktorok, például az aerob légzésszabályozó fehérje (ArcA), a fumarát- és nitrát-redukciót szabályozó fehérje (Fnr) és a ciklikus AMP-receptor fehérje (CRP) megköthetnek a vcFur-helyek közelében vagy egymást átfedő helyeken. A növekedési körülményektől függően ezek a tényezők jelentősen növelhetik vagy csökkenthetik a vcFur kötődését egy adott helyen.

Megmutattuk az új vcFur-csúcsokkal társított három gén közvetlen szabályozását egy fur: Tn mutáns alkalmazásával (2. és 4. táblázat). A VCA1098 erős homológiát mutat a NikA ABC nikkelszállító alegységgel (40), és kísérleteink azt mutatják, hogy a VCA1098 megbomlása csökkenti az V. cholerae érzékenységét az extracelluláris nikkel iránt (1D. Ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a VCA1098 szerepet játszhat a nikkelszállításban. Érdekes a Helicobacter mustelae esetében, hogy a közelmúltban számos vasszerzésre feljegyzett gént használtak be nikkelfelvételre (44). Emellett a NikA-ról kimutatták, hogy megköti a hemet, ami a VCA1098 többfunkciós használatára utal (45). Eredményeink azt is kimutatták, hogy az alternatív L31 riboszomális fehérje, a VC0878 promoter régiójához kötődő vcFur jelentős mértékben meggazdagodott. A VC0878 Bacillus subtilis homológot a Zur cinkfelvevő szabályozó szabályozza, és elősegíti a baktérium pufferelését a cink éhezés ellen (46). Továbbá bebizonyosodott, hogy a cink transzportját a Pasteurella multocida szőrme irányítja (47). A Ni 2+ és Zn 2+ szabályozásban potenciálisan szerepet játszó gének közvetlen társítása azt sugallja, hogy a vcFur a vasszabályozáson túl további szerepeket is betölthet.

Erős vcFur ChIP csúcsokat azonosítottunk a VC0142/VC0143 és a VCA0452/VCA0453 közötti intergenikus régiókban. Ezek a csúcsok nem egy gén kiindulási helyének közelében helyezkednek el. Livny és mtsai. (41) egy sRNS-t azonosított a VC0142/VC0143 közötti intergenikus régióban egy V. cholerae sRNS-ek számítási szűrése során. Northern-blotjaink ennek az sRNS-nek fokozott expressziót mutattak a szőr: Tn mutánsban (1E. Ábra). A vcFur ChIP lokalizációval kombinálva megmutattuk, hogy a vcFur közvetlenül szabályozza ezt a nem vizsgált sRNS-t. A VCA0452/VCA0453 közötti intergenikus régióban azonosítottunk egy olyan sRNS-t is, amely nem mutatott vcFur-függő szabályozást; a vcFur-függő szabályozás azonban eltérő növekedési körülmények között fordulhat elő.

Fur/RpoS keresztszabályozást figyeltek meg Vibrio vulnificusban és E. coliban (48, 49), de nem figyeltük meg az rpoS up-szabályozását egy szőr: Tn mutánsban (4. táblázat). Mint minden más, a vcFur-kötő helyhez kapcsolódó gén esetében, az erős vcFur-függő szabályozáshoz alternatív növekedési feltételek is szükségesek lehetnek.

Számos további vcFur-kötő hely azonosítása lehetővé tette számunkra, hogy megjósoljuk a fokozott V. cholerae Fur box konszenzus szekvenciát. Ezt a motívumot a vcFur ChIP csúcsain belül találtuk meg az egyes társított ORF-ek transzlációs kezdőhelyei közelében. Az in vitro vizsgálatok azt mutatták, hogy ez a motívum valamivel jobban megkötötte a vcFur-t, mint a korábban megjósolt vcFur box, amely csak a kötési régiónk egy részét használta. Érdekes módon mindkét doboz azonos alapterületű. Előrejelzésünknek szigorúbb követelménye van a 3'-végre vonatkozóan, ami arra utal, hogy ez a régió fokozott kötődést biztosíthat a vcFur-hoz. Megjósolt motívumunk képessége a vcFur hatékony megkötésére és jelenléte az összes azonosított ChIP-csúcsban (vcFur-kötött helyeken) segít támogatni az itt közölt új vcFur-kötő helyek érvényességét.

Anyagok és metódusok

A törzseket és a plazmidokat az S3 táblázat tartalmazza. A szekvenálást a HeliScope Single Molecule Sequencer segítségével végeztük. A szekvenálási adatok elemzését CLC genomi munkapad szoftverrel végeztük. A 6XHis C-terminális jelölt vcFur-ot affinitáskromatográfiával tisztítottuk. Részletes információkért lásd: SI anyagok és módszerek.

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük Dr. Ewen Cameron támogatását az V. cholerae transzpozon könyvtár használatában. B.W.D. támogatta a Jane Coffin Childs Orvosi Kutatási Emlékalap és a Kanadai Nemzeti Kutatási Tanács H. L. Holmes-díja. Ezt a munkát az Országos Egészségügyi Intézetek támogatták. AI-018045 támogatás (J.J.M. részére).

Lábjegyzetek

  • ↵ 1 Kinek kell címezni a levelezést. E-mail: john_mekalanoshms.harvard.edu .