A tenyésztett vörös hínár Chondrus crispus komponensei fokozzák a Caenorhabditis elegans Pseudomonas aeruginosa elleni immunválaszát a pmk-1, daf-2/daf-16 és skn-1 utakon keresztül

ABSZTRAKT

BEVEZETÉS

A moszatokban gazdag bioaktív vegyületek vannak, például fehérjék, peptidek, aminosavak, lipidek, rostok, pigmentek, polifenolok és poliszacharidok (1, 2), amelyek felelősek a különféle egészségügyi előnyökért. Például a β-karotint és a luteint antimutagén anyagként azonosították az ehető vörös algákban, ami jelezte azok lehetséges rákellenes aktivitását (3). Ezenkívül egereken/patkányokon és embereken végzett vizsgálatok azt mutatták, hogy a különféle tengeri moszatok különféle kivonataival végzett étrend-kiegészítés korrelált az emlőrák kockázatának csökkenésével (4, 5). Számos tengeri moszatból származó poliszacharidok, fehérjék, peptidek és aminosavak jótékony hatást mutattak a cukorbetegség, a rák, az AIDS és az érrendszeri betegségek ellen (2). A vörös moszat, a Chondrus crispus (Rhodophyta) széles körben elterjedt az Atlanti-óceán északi részén. Az itt bemutatott munkát egy sajátos C. crispus törzs felhasználásával végezték el, amelyet a kanadai Nova Scotia szárazföldjén termesztettek az ázsiai élelmiszerpiac számára az Acadian Seaplants Limited. Az összes fehérje, oligopeptid és pigment tartalma mellett ez a vörös alga gazdag vízoldható poliszacharid-karragenánban (CGN) (6), amelyről beszámoltak vírusellenes (7, 8) és daganatellenes (9, 10) tevékenységek.

A CGN-ek a digalaktóz-maradékok lineáris polimerjei, és kivonhatók néhány vörös hínárfajból. A CGN-ket széles körben használják az élelmiszeriparban sűrítőként, stabilizátorokként és emulgeálószerként. A C. crispus életciklusának különböző szakaszaiban háromféle CGN-t termel. A diploid sporophyte fázisban lambda-CGN-t termel, míg a haploid gametophyte túlnyomórészt kappa-CGN-t (K-CGN) termel némi iota-CGN mellett. A gametofita a kappa- és az iota-CGN-ek, a mu- és a nu-CGN-k prekurzor típusait is előállítja. A mu- és nu-CGN-k szulfatáltabbak, mint a kappa- és az iota-CGN-típusok, és nem hígító formájúak. Ezek a prekurzorok jobban hasonlítanak a lambda-CGN-re a szulfátszint és az oldhatósági tulajdonságok tekintetében (J. S. Craigie, személyes kommunikáció). A jelen munkában használt vízkivonat több vegyületet tartalmazott, a K-CGN a CGN fő típusa.

A C. elegans P. aeruginosa elleni immunválaszát a p38 mitogén-aktivált protein kináz (PMK-1), a β transzformáló növekedési faktor (TGF-β) és a DAF-2/DAF-16 inzulinszerű és ZIP-2 útvonalak (17–20). Nemrégiben kimutatták, hogy az Ascophyllum nodosum barna hínár kivonata megvédi a C. elegans-t a P. aeruginosa PA14 törzs által okozott fertőzéstől (21). Jelen tanulmányban a tenyésztett vörös hínár C. crispus-ból származó vízkivonat hatásait teszteltük a gazda immunitására és a PA14 patogenitására a C. elegans PA14-gyel történő fertőzési modelljének felhasználásával. Továbbá megvizsgáltuk a tiszta K-CGN, a C. crispusban jelen lévő domináns vízoldható poliszacharid hatását a gazda immunitására. Ezenkívül számos C. elegans mutáns vonalat használtunk a különböző jelátviteli utak szerepének meghatározására a K-CGN által kiváltott immunválaszban.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Hínárkivonatok készítése. Az ebben a vizsgálatban használt szárazföldi tenyésztésű C. crispus törzset az Acadian Seaplants Limited (Dartmouth, NS, Kanada) szerezte be. A szárított hínárt (250 g) vízzel (kétszer 1,5 literenként) extraháljuk ultrahanggal 1 órán át szobahőmérsékleten. A vizes frakciót csökkentett nyomáson bepároljuk, és éjszakán át fagyasztva szárítjuk, így vízkivonatot kapunk (CCWE; 67,1 g). A CCWE-t -20 ° C-on tároltuk. Kutatási minőségű K-CGN port a Cargill Texturant Systems-től (Franciaország) szereztek be. CCWE vagy K-CGN törzsoldatot készítettünk úgy, hogy a port desztillált vízben 25 mg/ml vagy 10 mg/ml koncentrációra feloldottuk, és 4 ° C-on tároltuk. A törzsoldatokat a felhasználás előtt legfeljebb 1 héttel készítettük el annak érdekében, hogy elkerüljük a bioaktív vegyületek lebomlását a hosszabb tárolás miatt.

Baktériumtörzs és tenyészet. A P. aeruginosa, a PA14 törzs klinikai izolátuma Eric Déziel (INRS, Institute Armand-Frappier-Microbiologieet Biotechnologie, Laval, QC, Kanada) szíves ajándéka volt. A PA14-et tenyésztettük és King B (KB) táptalajban vagy KB táptalaj agaron tartottuk, hacsak másképp nem jelöljük. -80 ° C-on tartott PA14 baktérium törzseket felolvasztottuk és 3 ml KB táptalajban tenyésztettük 37 ° C hőmérsékleten 6 órán át, állandó rázással, majd a tenyészetet csíkoztuk egy KB agar lemezre. A lemezt egy éjszakán át 37 ° C-on inkubáltuk, majd a KB agar lemezről egyetlen telepet szedtünk ki, 10 ml KB táptalajba oltottuk, és egy éjszakán át 37 ° C-on tenyésztettük állandó gyengéd rázással (150 fordulat/perc). A tenyészetet 600 nm-en (OD600) 1,0 optikai sűrűségre hígítottuk friss KB táptalajjal, 4 ° C-on tároltuk, és egy héten belül felhasználtuk.

Teljes proteázvizsgálat. A PA14-et 500 μg/ml CCWE jelenlétében (kezelés) vagy távollétében (kontroll) tenyésztettük, és a proteáz aktivitást spektrofotometriásan határoztuk meg 600 nm-en, a tenyészetben szekretált proteáz sovány tej hidrolízis hatékonyságának mérésével. A proteáz aktivitást mg/ml tenyészetenként óránként hidrolizált fehérje mg-ban fejeztük ki, a sovány tej sorozatos hígításából kapott standard görbe felhasználásával (sovány tejpor mikrobiológiai célokra; BDH) (23).

Lúgos proteázvizsgálat. 500 μg/ml CCWE jelenlétében (kezelés) vagy távollétében (kontroll) tenyésztett PA14 felülúszó lúgos proteáz aktivitását Hide-Remazol ragyogó kék szálas por (Sigma) alkalmazásával vizsgáltuk. A lúgos proteáz aktivitást egységekben fejezzük ki, ahol 1 egységet az OD595/ml/óra 1,0-es növekedésként határozunk meg (24).

Elasztázvizsgálat. 500 μg/ml CCWE jelenlétében (kezelés) vagy távollétében (kontroll) tenyésztett PA14 elasztáz aktivitását elasztin-kongó vörös por (Sigma) alkalmazásával határoztuk meg. Az elasztáz-aktivitást az OD495/ml PA14-szűrlet milliliterenkénti növekedéseként fejeztük ki (25).

HCN assay. A hidrogén-cianid (HCN) PA14 általi termelését 500 μg/ml CCWE jelenlétében (kezelés) vagy távollétében (kontroll) a HCN redukciós aktivitása következtében a nátrium-pikrát megváltozó színe szemléltette (26). A szűrőpapír korongokat nátrium-pikráttal telítettük, és a tenyésztőlemezek fedelének alsó oldalához rögzítettük, amelyeket PA14-gyel oltottunk be. A lemezeket lezárjuk és az eluálás előtt inkubáljuk, és a korongokon lévő barnássárga vegyületet spektrofotometriásan meghatározzuk. A megfelelő HCN mennyiségét OD625-ben fejeztük ki (27).

Pyocyanin assay. A piocianint 3 ml PA14-szűrletben, amelyet 500 μg/ml CCWE jelenlétében vagy hiányában tenyésztettünk, kloroform-HCl-oldattal extraháltuk, és mennyiségi meghatározást végeztünk az abszorbancia 520 nm-en történő meghatározásával, a korábbiakban leírtak szerint (28), kisebb módosításokkal.

Siderophore assay. A PA14 sziderofort 20 ml-es tenyésztési szűrletben (kezelés) vagy (kontroll nélkül) 500 μg/ml CCWE-vel extraháltuk etil-acetátban, nitrogén-bepárlóval szárítottuk (N-EVAP; Efamol Research Inc., Kanada), feloldottuk. etanolban, Hathway reagenssel elkeverve és az abszorbancia 700 nm-nél leolvasva. A sziderofor mennyiségét a tenyészet szűrletének OD700-ként fejeztük ki (29).

Mikrotiter lemez biofilm vizsgálat. A biofilm relatív mennyiségét az OD590 mikrolemez-olvasón (BioTek) leolvasásával határoztuk meg (30). 500 μg/ml CCWE jelenlétében (kezelés) vagy távollétében (kontroll) képződött PA14 biofilmet kristálylilával festettük és mostuk, majd meghatároztuk az etanollal eluált biofilm-konjugált festék abszorbanciáját. A biofilm mennyiségét OD590-ben fejeztük ki a szűrlet milliliterenként.

CCWE- és K-CGN-indukálta C. elegans vad típusú férgek túlélése a P. aeruginosa PA14 fertőzéssel szemben. Különböző CCWE és K-CGN koncentrációkat teszteltünk egy negatív kontrollhoz (víz) képest. Az 1. napon felnőtt táplálékkiegészítőként CCWE-vel vagy K-CGN-sel nevelt N2 férgeket PA14 baktérium gyepnek tették ki, amelyet CCWE vagy K-CGN jelenlétében hoztak létre. Az adatokat átlag ± SD-ként adjuk meg. A statisztikai adatokat lásd az 1. táblázatban.

A CCWE/K-CGN védi a vad típusú C. elegans-t a P. aeruginosa PA14 fertőzéssel szemben

A CCWE összetevőit megvizsgáltuk a gazda immunitás indukciójára gyakorolt hatásuk szempontjából. A CGN korábban jelentett immunmoduláló hatása és az a tény, hogy a CGN a CCWE készítményünk tömegének 40% -át tette ki (31), úgy indokoltuk, hogy a CCWE-ben domináns vízoldható poliszacharid, a K-CGN szerepet játszott a C. elegans PA14 fertőzés elleni megfigyelt védelmében. Következésképpen a tiszta K-CGN hatását a C. elegans fertőzés modelljével teszteltük. A jelen munkában használt K-CGN minta tisztaságát protonmagmágneses rezonancia erősítette meg Bruker 700 MHz-es spektrométeren (lásd a kiegészítő anyagban az S2 ábrát). A CCWE optimális koncentrációjának elérése érdekében 200 μg/ml K-CGN-t használtunk. A K-CGN megfigyelt védőhatásai hasonlóak voltak a CCWE-vel korábban megfigyelt hatásokhoz (1. ábra és 1. táblázat), különösen a 24 és 96 óra közötti időszakban, 20% -os védelmi arány mellett 120 órán (P C.). elegánsok nem fertőzéses körülmények között, és potenciális immunmodulációs hatást jelentenek a PA14 fertőzésre adott válaszként.

A daf-2/daf-16, pmk-1 és skn-1 jelátviteli utak elengedhetetlenek a K-CGN által kiváltott PA14 fertőzés elleni védelemhez. A négy funkcióvesztéses mutáció egyikével rendelkező mutánsokat, azaz azokat a mutánsokat, amelyek a daf-2, daf-16, pmk-1 vagy skn-1 immunválasz egyikében hibásak voltak, teszteltük, hogy melyik immunútvonal legyen fontos a K-CGN által kiváltott védelem szempontjából a halálos PA14 fertőzés ellen. Amint az a 2. ábrán látható, a K-CGN kezelés nem védett meg egy mutánt sem, míg az N2 férgeket védte, ami azt sugallta, hogy a funkcionális daf-2, daf-16, pmk-1 és az skn-1 elengedhetetlen a K- CGN által közvetített immunitás a PA14 ellen.

A K-CGN által kiváltott túlélés károsodott a daf-16, a daf-2, a pmk-1 és az skn-1 mutánsokban. A K-CGN-t kiegészítették a férgek táplálékforrásával az L1 korai stádiumától a felnőttkorig. Az első napon felnőtt férgeket ezután egy P. aeruginosa PA14 baktérium gyepre vitték, amelyet előzetesen létrehoztak K-CGN jelenlétében. Kontrollként a K-CGN-kiegészítés nélkül nevelt férgek szolgáltak PA-gyepen, amelyet K-CGN hiányában hoztak létre. P> 0,05 volt minden mutáns esetében, szemben ugyanazzal a mutánssal plusz K-CGN. Az adatokat átlag ± SD-ként adjuk meg.

A PA14-szekretált virulencia faktorok biokémiai vizsgálata. (A) A CCWE hatása a PA14 teljes proteáz aktivitására; (B) a CCWE hatása a PA14 lúgos proteáz aktivitására; (C) a CCWE hatása a PA14 elasztáz aktivitására; (D) a CCWE hatása a HCN termelésére PA14-ben; (E) a CCWE hatása a PA-14 pyocyanin termelésére; (F) a CCWE hatása a PA14 sziderofórtermelésére. Kontroll, CCWE-t nem adtunk a PA14 tenyészethez; A CCWE, PA14-et CCWE-vel tenyésztettük. A kísérleteket három biológiai ismétléssel és három technikai ismétléssel végeztük. Az adatokat átlag ± SD-ként adjuk meg. A P értékek, 0,001, 0,07, a CCWE gátolja a PA14 biofilm képződését. A biofilm jelenléte befolyásolja a PA14 patogenitását. A CCWE biofilm-képződésre gyakorolt hatását kristálylila festéssel tanulmányoztuk. Amikor 500 μg/ml CCWE volt jelen a táptalajban, a PA14 0,09 egység biofilmet képzett, ami háromszoros csökkenés volt a kontroll által képzett 0,29 egységhez képest (P = 0,001).

VITA

A P. aeruginosa PA14 klinikai izolátum patogén mind az Arabidopsis thaliana, mind a súlyosan megégett egerekre, az utóbbi esetben a PA14 fertőzés halálos (34). A patogenitást mind a növényi, mind az állatmodellben számos virulencia faktor közvetítette, beleértve a toxA-t, a plcS-t és a gacA-t. Érdekes módon a PA14 és a P. aeruginosa egy másik törzse, a PAO1 kimutatták, hogy akár órákban, akár napokban elpusztítja a talaj fonálféregét, a gyilkossági vizsgálatban alkalmazott növekedési közeg típusától függően (12, 35). Jelen tanulmányban a C. elegans fertőzési modellt alkalmaztuk a vörös hínár C. crispus kereskedelmileg termesztett törzséből származó vízkivonat hatásainak vizsgálatára mind a gazda immunitására, mind a P. aeruginosa patogenitására. Megfigyeltük, hogy 500 μg/ml CCWE volt a legjobb védelem a férgek PA14 elpusztításával szemben, míg a magasabb vagy alacsonyabb koncentrációk kevésbé voltak hatékonyak. Ez az eredmény összhangban volt azzal, amit korábban megfigyeltek a kereskedelemben betakarított barna hínár, A. nodosum kivonatánál, hasonló modellrendszerben (21).

A tengerparti vizekben virágzó tengeri moszatok robusztus védekezési mechanizmusokat fejlesztettek ki, például a QS gátlását a kórokozók, például a mindenütt jelenlévő P. aeruginosa baktérium ellen. Feltűnő, hogy a CCWE a PA14 patogén törzsben a QS gátlójaként mutatta be a tulajdonságait, ami azt sugallta, hogy a vörös hínár C. crispus önmagában előnyös lehet olyan alkalmazásoknál, amelyek nem csupán egy funkcionális élelmiszer önmagában. A növekedési görbe vizsgálatokban a CCWE és fő alkotóeleme, a K-CGN nem szüntette meg a PA14 növekedését (lásd a kiegészítő anyagban az S6. Ábrát). Ennek megfelelően egy korongdiffúziós tesztben a CCWE nem mutatott közvetlen antimikrobiális aktivitást (lásd a kiegészítő anyagban az S7. Ábrát). A CCWE azonban visszaszorította a PA14 QS gének expresszióját, és csökkentette a szekretált PA14 virulencia faktorok szintjét anélkül, hogy befolyásolta volna házkezelő génjeit (4. és 5. ábra). Érdekes, hogy egy másik vizsgálatban, amely 30 zöld, barna és vörös moszat fajtát szűrt meg, a kvórumérzékelő inhibitorok csak az Asparagopsis taxiformis vörös hínárban voltak jelen (36); a vörös algák egy másik faja, a Delisea pulchra volt az első tengeri moszat, amelyről beszámoltak arról, hogy anti-QS aktivitású vegyületeket tartalmaz (37).

A C. elegans fertőzési modell másik aspektusa az volt, hogy a kontroll N2 férgek PA14 által okozott megölésének végpontja nem volt korábbi 120 h postexpozíciónál, ami későbbi volt, mint a korábbi jelentésekben leírtak (12, 38). A lassabb ölés magyarázata lehet a FUdR használata ebben a tanulmányban. Az FUdR blokkolja a C. elegans (39) embrionális fejlődésének középproliferációs szakaszát, megakadályozva ezzel a peték kikelését, ami segített elkerülni az utódtermelés zavaró hatásait. Kimutatták, hogy a C. elegans immunszuppressziója korrelál a reprodukcióval, pontosabban a normális embrionális fejlődéssel. Beszámoltak arról, hogy a C. elegans steril mutánsai PA14-fertőzéses körülmények között hosszabb ideig éltek túl, mint a vad típusú N2 férgek, és ennek megfelelően a FUdR-vel kezelt férgek is tovább éltek (38).

Nevezetesen, jelenlegi munkánk során a kiválasztott immungéneket legalább négy különálló jelátviteli út szabályozta. Például az irg-1 és irg-2 fertőzésre adott válaszgéneket a zip-2 útvonal közvetíti, míg az ShK doménszerű szekretált F49F1.6 felszíni fehérjét és a C-típusú F56D6.2 lektint a PMK szabályozza. 1 útvonal (20). Ezenkívül a lizozim-szerű Lys-1 fehérjét mind a TGF-β, mind a PMK-1 jelátviteli út szabályozza, míg a CUB-szerű K08D8.5 fehérje mind a PMK-1, mind a DAF-2/DAF- szabályozása alatt áll. 16 inzulinszerű út (43). Ezenkívül úgy gondolták, hogy a szapszonin-szerű Spp-1 fehérjét a DAF-2/DAF-16 útvonal szabályozza, egy még ismeretlen útvonallal együtt (33). Így az immunválasz gének szabályozása különféle ismert és még ismeretlen jelátviteli utakkal tovább magyarázhatja az immunválasz gének differenciális expresszióját.