A telítetlen zsírsavak visszaállítják az étrend okozta hipotalamusz-gyulladást az elhízásban

Sejtjelzési laboratórium, Campinas Egyetem, Campinas, Brazília, Alkalmazott Tudományok Kar, Campinas Egyetem, Campinas, Brazília

Campinas Egyetem Belgyógyászati Osztálya, Campinas, Brazília

Sejtjelzési laboratórium, Campinas Egyetem, Campinas, Brazília

Campinas Egyetem Belgyógyászati Osztálya, Campinas, Brazília

Sejtjelzési laboratórium, Campinas Egyetem, Campinas, Brazília

Társadalom Élelmiszeripari Kar, Campinasi Egyetem, Campinas, Brazília

Campinas Egyetem Belgyógyászati Osztálya, Campinas, Brazília

Sejtjelzési laboratórium, Campinasi Egyetem, Campinas, Brazília, Campinas Egyetem Belgyógyászati Klinika, Campinas, Brazília

Dennys E. Cintra,
Eduardo R. Ropelle,
Juliana C. Moraes,
José R. Pauli,
Joseane Morari,
Claudio T. de Souza,
Renato Grimaldi,
Marcela Stahl,
José B. Carvalheira,
Mario J. Saad

Ábrák

Absztrakt

Háttér

Kísérleti modellekben a hipotalamusz gyulladása korai és meghatározó tényező az elhízás beiktatásában és előrehaladásában. A farmakológiai és génalapú megközelítések hatékonynak bizonyultak a gyulladás visszaszorításában és az elhízott fenotípusok korrekciójában. A tápanyagok szerepe a hipotalamusz gyulladásának modulációjában azonban ismeretlen.

Módszertan/fő megállapítások

Itt megmutatjuk, hogy az étrend által kiváltott elhízás egérmodelljében az étrend zsírsav-összetevőjének részleges helyettesítése lenmagolajjal (C18: 3 gazdag) vagy olívaolajjal (C18: 1-ben gazdag) korrigálja a hipotalamusz gyulladását, a hipotalamusz és az egész test inzulinrezisztenciája, valamint a test adipozitása. Ezen túlmenően, elhízott patkányok icv-injekciója esetén a ω3 és ω9 tiszta zsírsavak csökkentik a spontán táplálékfelvételt és a testtömeg-gyarapodást. Ezeket a hatásokat a leptinnel/inzulinnal szembeni funkcionális és molekuláris hipotalamikus rezisztencia megfordulása, valamint a megnövekedett POMC és CART expresszió kíséri. Ezenkívül mind a ω3, mind az ω9 zsírsav gátolja az AMPK/ACC útvonalat, és növeli a CPT1 és az SCD1 expresszióját a hipotalamuszban. Végül az ω3 és ω9 zsírsavak akut hipotalamusz injekciója aktiválja a jelátvitelt a nemrég azonosított GPR120 telítetlen zsírsav receptorokon.

Következtetések/jelentőség

A telítetlen zsírsavak tápanyagként vagy közvetlenül a hipotalamuszban működhetnek, visszafordítva az étrend által kiváltott gyulladást és csökkentve a test zsírosságát. Ezek az adatok azt mutatják, hogy a farmakológiai és genetikai megközelítés mellett a tápanyagok is vonzó jelöltek lehetnek az elhízás hipotalamusz-gyulladásának szabályozásában.

Idézet: Cintra DE, Ropelle ER, Moraes JC, Pauli JR, Morari J, de Souza CT és mtsai. (2012) Telítetlen zsírsavak visszaállítják az étrend által kiváltott hipotalamusz-gyulladást az elhízásban. PLoS ONE 7 (1): e30571. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0030571

Szerkesztő: Alicia J. Kowaltowski, Instituto de Química - Universidade de São Paulo, Brazília

Fogadott: 2011. április 8 .; Elfogadott: 2011. december 20 .; Közzétett: 2012. január 18

Finanszírozás: Ezt a munkát a Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Sao Paulo és a Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnologico támogatásai finanszírozták. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

A hipotalamusz hibás aktivitása fontos szerepet játszik az elhízás kialakulásában [1], [2], [3]. Számos friss tanulmány kimutatta, hogy mind az étrend által kiváltott, mind a genetikailag meghatározott elhízási állatmodellekben a hipotalamusz gyulladása fontos mechanizmus, amely a kalóriabevitel és az energiafelhasználás rendellenes szabályozásához vezet [4], [5], [ 6], [7], [8], [9]. A nyugati étrendben erősen elfogyasztott telített zsírsavak hipotalamusz-gyulladást váltanak ki a jelátvitel aktiválásával a TLR4 révén, amely endoplazmatikus retikulum stresszhez, gyulladásos citokinek in situ expressziójához és végül az idegsejtek apoptózisához vezet, amelyek mind hozzájárulnak az adiposztatikus hormon rezisztencia kialakulásához az energia homeosztázis szabályozásában részt vevő neurotranszmitterek anomális kifejeződése [5], [6].

A hipotalamusz gyulladásának visszaszorítására irányuló genetikai és farmakológiai megközelítés egyaránt hasznosnak bizonyult a hipotalamusz diszfunkciójának csökkentésében, a leptinnel és inzulinnal szembeni rezisztencia korrigálásában, valamint a testtömeg csökkentésében. Ebben az összefüggésben a hipotalamusz gyulladásos válaszában részt vevő több fehérjét megcélozták, általában pozitív eredménnyel. Néhány példa a génalapú megközelítéssel megcélzott SOCS3 és IKK [8], [10], valamint farmakológiai módszerekkel megcélzott TNF-α, JNK és TLR4 [4], [5], [11] ]. Bár ezek az eredmények ígéretes megközelítéseket mutatnak be az elhízás kezelésében, mindezen gyulladásos utak ismert pleotropiája, valamint az igény, hogy a hatást az agy korlátozott területére kell koncentrálni, bizonyos adag bizonytalanságot vetnek fel a gyulladáscsökkentők jövőbeli fejlődésével kapcsolatban gyógyszerek az elhízás kezelésére.

Más szövetekben és sejttípusokban a telítetlen zsírsavak jól ismert gyulladáscsökkentő hatásokkal rendelkeznek, amelyek a lipoxigenáz és a cikloxigenáz útvonalainak gátlásától és a neutrofil adhézió csökkenésétől [12] a gyulladásos citokin expresszió csökkentéséig terjednek [13] és a TLR4 jelzés [14]. Mivel a táplálkozási megközelítések jelentik az elhízás kezelésére alkalmazott összes profilaktikus és terápiás protokoll alapját, úgy döntöttünk, hogy megvizsgáljuk két telítetlen zsírsav hatását az elhízás hipotalamusz gyulladására. Itt megmutatjuk, hogy a tápanyagként vagy közvetlenül a hipotalamuszban fellépő linolén (C18: 3, ω3) és oleinsav (C18: 1, ω9) telítetlen zsírsavak kiemelkedő gyulladáscsökkentő hatással bírnak, korrigálják a hipotalamusz diszfunkcióját és csökkentik a testtömeget.

Anyagok és metódusok

Kísérleti állatok

Patkányokat és egereket a University of Campinas Tenyésztési Központból szereztünk be. A kezdeti 180 g testtömegű hím Wistar patkányoknak (Rattus norvegicus) standard rágcsáló chow (CT) vagy magas zsírtartalmú étrend (HF) hozzáférést engedélyeztek az alábbiakban és az 1. táblázatban leírt protokoll szerint. Hím svájci egerek ( Mus musculus), kezdeti testtömegük 13 g, hozzáférést kaptak a standard rágcsáló-chow (CT), a magas zsírtartalmú étrendhez (HF), a HF + lenmagolajhoz (FS) (lépésenként 10, 20 vagy 30% -nak megfelelő szubsztitúciók). teljes kalóriaérték) vagy HF + olívaolaj (OL) (lépésenkénti szubsztitúciók, amelyek a teljes kalóriaérték 10, 20 vagy 30% -ának felelnek meg), az alábbiakban és az 1. táblázatban leírtak szerint. Minden állat táplálékot és vizet kapott ad libitum, és egyedi ketrecek 21 ± 2 ° C-on, 12 órás sötét/12 órás fényciklussal. Valamennyi kísérletet az Országos Egészségügyi Intézetnek a kísérleti állatok gondozására és felhasználására vonatkozó iránymutatásaiban ismertetett elvekkel és eljárásokkal összhangban hajtották végre, és a Campinasi Egyetem Etikai Bizottsága jóváhagyta őket (ID 2010/0256).

Kísérleti protokollok

Antitestek, vegyszerek és pufferek

Intraperitoneális inzulin tolerancia teszt (ipITT)

6 órás éhgyomorra után CT, HF, FS- és OL-szubsztituált egércsoportokat inzulin tolerancia tesztnek vetettek alá (1 U/testtömeg-kg inzulin). Az egereket inzulinnal injektáltuk, és vérmintákat vettünk 0, 4, 8, 12 és 16 percnél a farokvénából a szérum glükóz meghatározásához. A szérum glükóz eltűnési sebességének állandóját a 0,693/biológiai felezési idő (t1/2) képlettel számítottuk. A plazma glükóz t1/2 értékét a plazma glükózkoncentrációjának utolsó négyzetelemzésének meredekségéből számítottuk a lineáris csökkenési fázisban [15].

Intraperitoneális glükóz tolerancia teszt (ipGTT)

6 órás éhezés után az egereknek glükóz tolerancia tesztet vetettek alá. Miután nem vitatott mintát vettünk (0. idő), 20% glükóz (2,0 g/testtömeg-kg) oldatot adtunk a hasüregbe. Vérmintákat gyűjtöttünk a farokvénából 30, 60, 90 és 120 percen belül a glükózkoncentráció meghatározásához. Az eredményeket a glükózgörbék alatti területként mutatjuk be. Az ipITT vagy az ipGTT szérum glükózszintjét glükózmérővel határoztuk meg (Roche Diagnostic, Rotkreuze, Svájc).

Etetési magatartás

A 6 órán át tápláléktól nélkülözött patkányokhoz, szabadon hozzáférve a vízhez, icv-t (2 μl) injektáltunk albumint (75 µM) vagy leptint (1,0 µM) tartalmazó oldatokkal. Ezt követően újból bevezették a diétákat, és egy 12 órás periódus végén meghatározták a táplálékfelvételt.

Icv kanül

Az étrendben az általános lipidtartalom és az LPS meghatározása egy korábban leírt HPLC módszerrel történt [18]. Röviden, a zsírsavakat 4-bróm-metil-7-kumarinnal derivatizáltuk, és az elemzést Shimadzu LC-10A típusú folyadékkromatográfussal végeztük. A mintákat C8 oszlopon (25 cm × 4,6 id, 5 µm részecskék), C8 előoszlopon (2,5 cm × 4,6 id, 5 µm részecskék), 1,0 ml/perc acetonitril/víz (77%/23) alkalmazásával eluáltuk. %, v/v) áramlás- és fluoreszcencia detektor (325 nm gerjesztés és 395 nm emisszió). A zsírsavak számszerűsítéséhez meghatározták a kapacitástényezőt, az elúciós szekvenciát, a linearitást, a visszanyerést, a pontosságot, az interferenciát és a kimutatási határt. A kimutatás alsó határa 1,0 pg volt, és nagy tisztaságú LPS-t használtunk nyomjelzőként.

Gáz kromatográfia

Az étrendben a zsírsavak, a vér és a hipotalami relatív mennyiségét gázkromatográfiával határoztuk meg, Shimadzu 17A modell alkalmazásával, a következő működési körülmények között: kondenzált szilícium-dioxid-kapilláris oszlop (100 × 0,25 mm; SP-2560); hidrogén hordozógázként 20 cm/s áramlási sebességgel; a kemence hőmérsékletét, kezdetben 140 ° C-on 5 percig, 240 ° C-ra emeltük 4 ° C/perc sebességgel, és 30 percig 240 ° C-on tartottuk; injektor, osztási arány 1-50, hőmérséklet 250 ° C; a párolgási hőmérséklet és a detektor hőmérséklete 250 ° C 260 ° C volt. Az injekciós térfogat 1 µl mintaoldat volt. A csúcsok azonosításához a metil-észter standardok (Sigma Aldrich) retenciós idejét használtuk. A diétákból kivont lipideket, vért és hipotalamit fénytől védve -20 ° C-on tároltuk.

Immunhisztokémia és szövettan

Fehérjeelemzés immunprecipitációval és immunblottozással

Valós idejű PCR. A reverz transzkripciót a hipotalamusz mintákból származó teljes RNS felhasználásával hajtottuk végre, amint azt korábban leírtuk [19]. Az NPY, POMC, CART és MCH mRNS-eket CD vagy HF étrenddel kezelt patkányok hipotalamijában, valamint linolén- és olajsavval kezelt intracerebroventrikuláris kanülezett patkányokban mértük. Az NPY, az AGRP, az MCH és a POMC intronátugráló primereit az Applied Biosystems cégtől szereztük be. Gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz primereket (Applied Biosystems) használtunk kontrollként. A génexpresszió valós idejű PCR-analízisét ABI Prism 7700 szekvencia detektáló rendszerben (Applied Biosystems) végeztük. A cDNS és a primerek optimális koncentrációját, valamint az amplifikáció maximális hatékonyságát minden gén esetében ötpontos, kétszeres hígítási görbe-analízissel kaptuk. Mindegyik PCR 3,0 ng reverz transzkripciójú RNS-t, 200 nM minden specifikus primert, SYBR SAFE PCR mester keveréket és RNáz-mentes vizet adott 20 µl végső térfogathoz. A valós idejű adatokat a Sequence Detector System 1.7 (Applied Biosystems) segítségével elemeztük.

Statisztikai analízis

A blotokban jelen lévő specifikus fehérje sávokat digitális denzitometriával (ScionCorp) számszerűsítettük. A független minták összehasonlításához varianciaanalízist alkalmaztunk. A densitometriás vizsgálatokból és a valós idejű PCR-mérésekből, a testtömeg-meghatározásból, a táplálékfelvételből, a glükózgörbék alatti területből és a Kitt-ből származó átlagértékeket ± SEM-t Tukey-teszt és P táblázat segítségével hasonlítottuk össze. A diéták zsírsav-összetétele (az összes zsír% -a ).

Az étrend változásának hatása a vérre és a hipotalamusz zsírsavakra

A HF-étrend fogyasztása a C18: 0, C20: 0 és C22: 0 szignifikáns növekedéséhez és a vér összes ω3-értékének jelentős csökkenéséhez vezetett a chow-val etetett egerekhez képest (3. táblázat). A 10% -os FS szubsztitúció a vér összes ω3 tartalmának jelentős növekedését és az ω6∶ω3 arány 7,1-ről 3,2-re történő csökkenését eredményezte a HF-vel táplált egerekhez képest (3. táblázat). A 10% -os OL-szubsztitúció nem eredményezte a vér összes ω9-tartalmának szignifikáns növekedését, de a telített zsírsavak teljes vértartalmának jelentős csökkenését eredményezte a HF-vel táplált egerekhez képest (3. táblázat). A hipotalamuszban a HF-étrend szignifikáns C20: 0 és C22: 0 növekedést produkált a chow-val etetett egerekhez képest (4. táblázat). A 10% -os FS-szubsztitúció a C20: 0 és C22: 0 szint csökkenését és az ω6∶ω3 arány csökkenését eredményezte a hipotalamuszban 1,12,29-ről 1,1,65-re a HF-vel táplált egerekhez képest (4. táblázat). A 10% -os OL szubsztitúció a relatív C20: 0 és C22: 0 tartalom jelentős csökkenését eredményezte a hipotalamuszban a HF-vel táplált egerekhez képest (4. táblázat).

Az étrendben az FS és az OL szubsztitúciók csökkentik a táplálékfelvételt és a testtömeg-növekedést

A, átlagos napi spontán táplálékfogyasztás (g) svájci egerekből, akiket rendszeres chow-val (CT), magas zsírtartalmú étrenddel (HF), lenmag- (FS) vagy olívaolajjal (OL) helyettesítettek (10, 20 vagy 30%) ) diéták nyolc hétig; Az eredményeket napi táplálékfogyasztásként (A) és az egész időszak alatt elért átlagként (A1) mutatjuk be. B, Testtömeg-változás az egyes csoportok számára a teljes kísérleti időszak alatt. C-E, testtömeg-változás (g) a 60 napos kísérleti periódusban (C-E) vagy mind a négy 15 napos kísérleti periódusban (C1-E1) a CT- és HF-csoportokban (C, C1); az FS-szubsztituált csoportok (D, D1) esetében; és az OL szubsztituált csoportok (E, E1) esetében. F, Diet preference assay, a sovány svájci egereket 10 órán át éheztetett, majd hasonló mennyiségű CT vagy HF (HF) étrendet kínáltak; ugyanezt a megközelítést alkalmazták az FS vagy OL helyettesített étrend előnyének összehasonlítására a HF ellen; Az eredményeket a tesztelt étrend relatív kalóriafogyasztásaként mutatjuk be 12 óra alatt. Minden kísérletben n = 5; A és B, #p 3. ábra. Metabolikus paraméterek.

Vércukorszint (A), és állandó a glükóz bomlásához inzulin tolerancia teszt során (Kitt) (%/perc) (A1); és a vércukorszintet (B) és a glükózgörbe alatti területet (AUC) (B1) intraperitoneális glükóztolerancia-teszt (ipGTT) során kaptuk egy nyolc hetes kísérleti időszak végén a svájci egereknek, akiket rendszeresen szarvasmarhával etettek (CT). ), magas zsírtartalmú étrend (HF), lenmag- (FS) vagy olívaolaj- (OL) helyettesített (10, 20 vagy 30%) étrend. Minden kísérletben n = 5; #p 4. ábra. Jelátvitel a hipotalamuszban.

Hét héten át rendszeres chow (CT), magas zsírtartalmú étrend (HF), lenmag- (FS) vagy olívaolajjal (OL) szubsztituált (10, 20 vagy 30%) étrenden táplált svájci egerekből nyert hipotalamusz összes fehérjekivonat immunoblotting (IB) kísérletekben alkalmaztuk a fehérje expresszió és/vagy aktivitás értékelésére. Specifikus antitestek foszfo-IBB-α (P-IκBα) (A), foszfo-JNK (P-JNK) (B), TNF-a (C), SOCS-3 (D), iNOS (E), IL- 10 (F), Caspase-3 (CASP-3) (G), BAX (H), Bcl-2 (I), foszfo-ACC (P-ACC) (J), FAS (K) és CPT-1 ( L) felhasználásával azonosítottuk a megfelelő fehérje célokat. A betöltést a membránok anti-β-aktinnal (A, C-I, K és L), anti-JNK (B) vagy anti-ACC (J) antitestekkel történő újszondázásával értékeltük. Minden kísérletben n = 5; # p 5. ábra. Táplálékfelvétel, testtömeg és zsírosság az icv-vel kezelt patkányokban.

Rendszeres chow-val (CT) vagy magas zsírtartalmú étrenden (HF) táplált Wistar patkányokat ivv-kanülben tartottak, és öt (A) vagy hét (BF) napig hígítószerrel (albumin, Alb), ω3-, ω9-zsírsavval kezelték őket. savak vagy sztearinsav (SA), majd az etetési viselkedés és az adipozitás meghatározására használják. A, napi táplálékfelvétel (g) patkányokon, amelyeket icv-vel kezeltek Alb (töltött körök), ω3 (kitöltött négyzetek) vagy ω9 (töltött háromszögek) zsírsavakkal öt napig; a kezelés kezdetét (I) és végét (II) nyilakkal jelöljük. B, A spontán táplálékfelvétel (g) leptin általi elnyomását a kísérleti időszak végén értékeltük. C, Testtömeg-változás (g) a hétnapos icv-kezelési periódus alatt. D, epididimális zsírtömeg (g) a kísérleti időszak végén. E, epididymális zsír szövettani értékelése (hematoxilin-eozin festés 5 µm-es szakaszokon). F, átlagos szövettani metszetekből nyert adipocita terület. Minden kísérletben n = 5. A, C és D esetén * p 6. ábra. Gyulladásos és apoptotikus fehérjék expressziója icv-vel kezelt patkányok hipotalamuszában.

A rendszeres chow-val (CT) vagy a magas zsírtartalmú étrenden (HF) táplált és icv-vel kanült Wistar patkányokat hét napig hígítószerrel (albumin, Alb), ω3 vagy ω9 zsírsavakkal kezelték, majd immunoblottingban (IB) és immunfluoreszcencia kísérletek. Az iNOS (A), IL-6 (B), TNF-a (C), IL-10 (D), foszfo-JNK (P-JNK) (E), BAX (G) és Bcl-2 elleni specifikus antitestek (H) -t alkalmaztunk a megfelelő fehérje célok meghatározására a hipotalamusz mintákban. A betöltést úgy értékeltük, hogy a membránokat újból próbáztuk anti-β-aktinnal (A-D, G és H) vagy anti-JNK (E) -vel. F-ben a hipotalamusz 5 um-os szakaszait anti-F4/80 antitesttel jelöltük. Minden kísérletben n = 5. Az A-E, * p 7. ábra: icv ω3 és ω9 hatása a hipotalamusz jelátvitelére.

A rendszeres chow-val (CT) vagy magas zsírtartalmú étrenden (HF) táplált és icv-vel kanült Wistar patkányokat hét napig hígítószerrel (albumin, Alb), ω3 vagy ω9 zsírsavakkal kezeltük. Ezenkívül néhány kísérletben a patkányokat akutan egyszeri dózisban vagy leptinnel (2 µl, 10-6 M: AG), vagy inzulinnal (2 µl, 10-6 M: H) kezelték, majd immunoblottingban (IB) alkalmazták. kísérletek. Specifikus antitestek foszfo-JAK2 (P-JAK2) (A és D), foszfo-STAT3 (P-STAT3) (B és E), foszfo-Akt (P-Akt) (C, F és H), foszfo-FoxO1 ellen (P-FoxO1) (G), foszfo-ACC (P-ACC) (I), FAS (J), CPT-1 (K) és SCD-1 (L) felhasználásával azonosítottuk a megfelelő fehérje célpontokat a hipotalamusz szövetében. A betöltést a membránok anti-β-aktinnal (JL), anti-JAK2 (A és D), anti-STAT3 (B és E), anti-Akt (C, F és H), anti- FoxO1 (G) vagy anti-ACC (I). Az A-H, #p 8. ábrán. Az icv ω3 és ω9 hatása a neurotranszmitter expressziójára és a termogenezisre.

A rendszeres chow-val (CT) vagy a magas zsírtartalmú étrenden (HF) táplált és icv-vel kanült Wistar patkányokat hét napig hígítószerrel (albumin, Alb), ω3 vagy ω9 zsírsavakkal kezelték, majd valós idejű PCR-ben és immunblot-kísérletek. A hipotalamiból nyert teljes RNS-t valós idejű PCR-ben használtuk az NPY (A), az MCH (B), a POMC (C) és a CART (D) mRNS-ének amplifikálásához. Az UCP-1 expresszió immunoblot (E) kiértékeléséhez barna zsírszövet összes fehérje kivonatot használtunk. Minden kísérletben n = 5. Az A-D, * p 9. ábra. GPR120 jelátvitel a hipotalamuszban.