A niacin finomhangolja az energiaháztartást a kanonikus GPR109A jelzésen keresztül

Absztrakt

A niacint régóta nagy hatású gyógyszerként tartják számon a lipid rendellenességek jótékony kezelésében, azonban a közelmúltban végzett kutatások megkérdőjelezték annak ateroszklerotikus hatásait. Itt bebizonyítottuk, hogy a niacin orális kiegészítése a testtömeg és a zsírtömeg jelentős csökkenését eredményezte anélkül, hogy befolyásolta volna a táplálékfelvételt a magas zsírtartalmú étrenddel táplált vad típusú egereknél, de a GPR109A-hiányos egereknél nem. További vizsgálatok kimutatták, hogy a niacin-provokáció a máj lipogenezisének figyelemre méltó gátlásához vezetett GPR109A-függő ERK1/2/AMPK útvonalon keresztül. Ezenkívül kimutattuk, hogy a niacinnal végzett kezelés stimulálta a termogenezist a barna zsírszövetben termogén gének indukciójával GPR109A-n keresztül. Ezenkívül megfigyeltük, hogy a niacinnak kitett egerek drámai csökkenést mutattak a zsírsavak bélfelszívódásában. Adataink együttesen azt mutatják, hogy a GPR109A-ra hatva a niacin megmutatja az energia homeosztázis fenntartásának lehetőségét a máj lipogenezisének, a BAT/bézs termogenezisnek és a bélzsír felszívódásának finomhangolásával, amely potenciális megközelítést jelent a lipid rendellenességek kezelésében.

Bevezetés

A túlsúly és az elhízás előfordulása globális járványsá vált, világszerte több mint 1,9 milliárd túlsúlyos és 600 millió elhízott egyén van (Ng et al, 2014; Wang et al, 2011). Az elhízást az energia lipidként történő rendellenes felesleges tárolása okozza a zsírszövetben, az energiafelvétel és az energiafelhasználás közötti nettó egyensúlyhiány miatt (Lowell & Spiegelman, 2000; Olsen et al, 2017). Az elhízást számos társbetegség fő kockázati tényezőjének tekintik, beleértve a főbb betegségeket, például a szív- és érrendszeri betegségeket, a cukorbetegséget és a rákot (Haslam és James, 2005; Kopelman, 2000). A legutóbbi hatalmas erőfeszítések ellenére azonban az elhízás elleni hatékony gyógyszerterápiák még mindig korlátozottak. Ezenkívül a mai napig az elhízás elleni szereket úgy tervezték, hogy csökkentsék a táplálékfelvételt és az étvágyat a hipotalamusz-alapú molekuláris utakon keresztül, de sajnos ezek a szerek súlyos pszichiátriai vagy kardiovaszkuláris mellékhatásokat mutatnak (Cunningham & Wiviott, 2014; Manning et al, 2014; Moreira és mtsai, 2009). Ezért a jelenlegi egészségügyi járvány nagysága fokozta az alternatív terápiás stratégiák iránti igényt, amelyek célja a testtömeg szabályozása a perifériás nem neuronális szövetekben lévő potenciális célpontok révén.

A csökkenő plazma koleszterinszint felfedezésének 1955-ös felfedezése óta a nikotinsavat (niacint) több mint fél évszázada használják diszlipidémia kezelésére, mint jóváhagyott gyógyszer (Altschul és mtsai, 1955; Carlson, 2005). Számos randomizált klinikai vizsgálat kimutatta, hogy a niacin monoterápiáról kimutatták, hogy lényegesen növeli a HDL-C szintjét és csökkenti a triglicerid szintet (Elam és mtsai, 2000; Guyton és mtsai, 1998). Pontos mechanizmusát azonban nem értették jól, amíg a GPR109A árva-receptort (amelyet nemrégiben hidroxil-karbonsav-receptor 2-nek vagy HCA2-nek nevezték el) 2003-ban három kutatócsoporttól függetlenül azonosították a niacin iránti nagy affinitású receptorként (Offermanns et al. 2011; Soga és mtsai, 2003; Tunaru és mtsai, 2003; Wise és mtsai, 2003). Ezt követően a keton test β-hidroxi-butirátot a GPR109A endogén ligandumaként azonosították (Taggart és mtsai, 2005). Adipocitákban, a niacin általi stimuláció után, a GPR109A Gi/o fehérjék révén működik, csökkentve az intracelluláris cAMP-termelést, ami a fehérje-kináz A-mediált hormon-érzékeny lipáz (HSL) aktivációjához vezet, ami viszont csökkenti a triglicerid hidrolízist szabad zsírsavakká ( FFA) (Digby és mtsai, 2009). Ezt az FFA hipotézist alátámasztják annak bizonyítékai, hogy a niacin nem tudta csökkenteni az FFA és TG értékeket GPR109A-knockout egerekben (Tunaru és mtsai, 2003).

A niacin-kezelés kardiovaszkuláris eseményekre vonatkozó megállapított klinikai előnyeit vitatták a legújabb tanulmányok, amelyek kimutatták, hogy a niacin jótékony hatásait a GPR109A által közvetített érelmeszesedés-gátló hatásra fejti ki, függetlenül annak lipolitikus tulajdonságaitól (Lukasova et al, 2011a; Wu et al, 2010 ). Ezek az adatok azonban nem zárták ki annak lehetőségét, hogy a niacin anti-lipolízistől független módon kardiovaszkuláris előnyöket nyújt a GPR109A révén. A niacin által közvetített jótékony kardiovaszkuláris hatásról kimutatták, hogy a GPR109A-kompetens csontvelő sejtekkel transzferálható (Wu és mtsai, 2010). Ezenkívül felhalmozódó bizonyítékok igazolták, hogy a GPR109A aktiválása nemcsak az ateroszklerózisra, hanem az akut ischaemiás stroke-ra, az ízületi gyulladásra, a krónikus veseelégtelenségre és a szepszisre is képes gyulladáscsökkentő hatásokat kiváltani az immunsejtek kemotaxisának gátlásával és a gyulladáscsökkentő citokin termeléssel ( Chen és mtsai, 2014;

Cho és mtsai, 2009; Digby és mtsai, 2012; Kwon és mtsai, 2011; Lukasova és mtsai, 2011a; Mitrofanov és mtsai, 2005; Rahman és mtsai, 2014; Shehadah és mtsai, 2010; Shi és mtsai, 2017; Wu és mtsai, 2010). Ezért további vizsgálatokra van szükség a GPR109A által közvetített pleiotrop hatások alapos értékeléséhez az aterogenezisre és más anyagcsere-betegségekre.

A GPR109A által kiváltott gátlás az adipocita lipolízisében és a zsírsav mobilizációban a niacinnal történő hosszú távú kezelésre adott válaszként a TG-k túlzott szintézisét és elhízást eredményezné (Ganji és mtsai, 2004). A Dr. Offermanns laboratóriumából bevezetett GPR109A-knockout egerek tenyésztési folyamata során azonban azt tapasztaltuk, hogy a GPR109A-knockout egerek hajlamosabbak az elhízásra, mint a vad típusú egerek. Ezért megkezdtük ezt a vizsgálatot a niacin/GPR109A szerepének vizsgálatára a lipid anyagcsere szabályozásában GPR109A-knockout egerek és magas zsírtartalmú étrend (HFD) által kiváltott elhízás egér modell alkalmazásával. Megmutattuk, hogy a niacinnal történő aktiválás után a GPR109A finombeállítja a lipid anyagcserét több útvonalon keresztül, beleértve a hepatocita lipogenezisének gátlását és a zsírsavabszorpciót, valamint elősegíti a barna zsírszövet (BAT) termogenezisét.

Eredmények

A GPR109A hiányos állatok elhízást mutatnak

A, B A testtömeg (A) és a táplálékfelvételt (B) hetente regisztráltuk (n = 16-17). C A zsírtömeg reprezentatív képeit mutatták. D Reprezentatív SEM képek a májban (bal oldali panelek; skála oszlopok, az ábrán látható módon) és az i izomban (középső panelek; skála oszlopok, az ábrán látható módon), valamint H -/- egerekben és egerekben, amelyek egy specifikus kismolekulával CHBA-val vannak fertőzve. agonista a GPR81-hez (2F. és EV2A. ábra). Végeztünk glükóz tolerancia tesztet (GTT) és inzulin tolerancia tesztet (ITT) is, és dokumentáltuk, hogy a niacinnal kezelt egerek kevésbé tolerálták a glükózt, de inzulin toleranciát mutattak, összehasonlítva a kontroll egerekkel (2G ábra). A niacinnal kezelt Gpr109a -/- egerekben és a CHBA-val fertőzött vad típusú egerekben nem észleltünk változást a GTT-n és az ITT-n (EV2B ábra). A kvantitatív elemzés azt mutatta, hogy a niacinnal végzett kezelés a vér inzulinjának jelentős csökkenését eredményezi (2H ábra), azonban a HFD-vel táplált egerek niacinnal történő kiváltása a HOMA-IR értékek jelentős csökkenését mutatta a hordozóval kezelt egerekhez képest (2I. Ábra). a niacin jótékony szerepe az inzulinérzékenységben.

A GPR109A hiánya megakadályozza a niacin elhízás elleni hatását

A GPR109A szerepének további érvényesítése érdekében a niacin elhízás elleni akciójában a HFD-vel táplált Gpr109a -/- hím egereket niacinnal hivtuk meg. Amint a 3. ábrán látható, a HFD-vel táplált Gpr109a -/- egerek kihívása niacinnal hasonló súlygyarapodást, zsírszöveti súlyt, szervtömeget és táplálékfelvételt mutatott, mint a hordozóval kezelt Gpr109a -/- egerek (3A-C, és E). A szövettani megfigyelés szintén nem mutatott különbséget a lipidfelhalmozódásban a niacinnal kezelt és a hordozóval kezelt Gpr109a -/- egerek között (3D ábra). Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a niacin a GPR109A révén fejti ki szabályozó hatását a lipid metabolizmusra.

A, B A testtömeg (A) és a táplálékfelvételt (B) hetente regisztráltuk (n = 10-11). C A zsírtömeg reprezentatív képeit mutatták. D Reprezentatív SEM képek a májban (bal oldali panelek; skála oszlopok, az ábrán látható módon) és az izmokban (középső panelek; skála oszlopok, az ábrán látható módon), valamint az epididymális fehér zsírszövet (eWAT) H&E festése (jobb oldali panelek; skála oszlopok), 100 μm). E A zsírpárnát és a szervek súlyát feljegyeztük az egerek érzéstelenítése után (n = 10-11). Adatinformációk: Az összes adat középértékként ± SEM. (A, B, E) -ben az adatokat párosítatlan kétfarkú tanuló t-tesztjével elemeztük. ns, nem szignifikáns.

A niacin a GPR109A révén közvetlenül gátolja a hepatocita lipogenezist

Adataink egyértelműen azt mutatták, hogy niacinnal történő aktiváláskor a GPR109A gátló hatását fejti ki a zsírszövetben, a májban és az izomban lévő lipidfelhalmozódásra HFD-vel táplálva. Ezenkívül az olajvörös O-festés és a kvantitatív elemzés feltárta, hogy a HFD-vel táplált egerek a máj triglicerid-tartalmának jelentős növekedését mutatták, míg a niacin-kiegészítés a máj triglicerid-tartalmának jelentős csökkenéséhez vezetett (4A és B ábra), ezzel szemben nincs különbség TC és FFA szinteket figyeltünk meg (4B. Ábra). Ezenkívül a máj inzulinszintjének csökkenését figyelték meg a niacinnal fertőzött egerekben (4.C ábra), ami egybeesik a szérum eredményével. Az állatok táplálékfelvétele azonban változatlan marad. Ezután megvizsgáljuk, hogy a niacin szerepet játszik-e a lipogenezis GPR109A-n keresztüli szabályozásában. Először qRT-PCR-t használtunk a GPR109A expresszió kvantitatív elemzésére az egér májában.

Az AMPK és az ERK1/2 részt vesz a hepatocita lipogenezis GPR109A által közvetített gátlásában

Kiértékeltük továbbá a niacin/GPR109A jelátvitel szerepét a preadipocita differenciálódásban. A niacin stimuláló hatást mutatott a barna zsír-prekurzor sejtek differenciálódása-indukciójára, maximális aktivitással 250 μM-nál (6F. Ábra). További valós idejű RT-PCR elemzés feltárta, hogy a niacin-kezelés szignifikánsan fokozta az UCP1, a PGC-1a és a PRDM16 transzkriptumszintjét (6G ábra).

A niacin stimuláció csökkenti a zsírsav felszívódását a GPR109A ellenére

A A széklet tömegét testtömegre (mg/g) normalizáltuk. A széklet lipidjeit kivontuk, és a széklet lipid koncentrációját a lipid milligrammjában/gramm széklet tömegében fejeztük ki. A teljes trigliceridet, az összes koleszterint és a szabad zsírsavat (FFA) WT egerekben mértük (n = 7,9). B A széklet lipid mutatóit Gpr109a -/- egerekben mértük (n = 6). C A belekből izolált összes mRNS, amely megvizsgálta a jelzett gének mRNS expresszióját, amelyek szerepet játszanak a zsírsavabszorpcióban (zsírsav transzporter fehérje 4 (FATP4) és a bél típusú zsírsavat kötő fehérje (I-FABP)) és a koleszterin felszívódásában (Niemann-Pick C1 -Like 1 (NPC1L1)) qRT-PCR segítségével. Adatinformációk: Az összes adat középértékként ± SEM. Az (F, G) szakaszban a bemutatott sejtek összes adata legalább három független kísérletet reprezentál. Az adatokat párosítatlan kétfarkú tanuló t-tesztjével elemeztük. * P -ΔΔ CT módszer. A qRT-PCR ciklusok a következők voltak: 1. lépés: preparatív denaturálás (30 s 95 ° C-on); 2. lépés: 40 denaturációs ciklus (5 s 95 ° C-on) és izzítás (30 s 60 ° C-on); 3. lépés, disszociáció a gyártó protokollja szerint. A valós idejű PCR-analízis során használt PCR-primereket az S1 táblázat tartalmazza.

Félkvantifikációs PCR

A teljes RNS-t RNAiso reagenskészlettel extraháltuk. A cDNS-t PrimeScript RT reagenskészlet segítségével szintetizáljuk. A PCR-t 20 μl reakcióelegyben hajtottuk végre a KOD-Plus (TOYOBO, Japán) utasításai szerint. A GPR109A-hoz használt primereket az 1. táblázatban tüntettük fel. A PCR-t kezdeti denaturálással végeztük 94 ° C-on 5 percig, majd 28 ciklust folytattunk 94 ° C-on 30 másodpercig, 53 ° C-on 30 másodpercig és 68 ° C-on 30 percig. másodpercig. 28 ciklus után további megnyújtási lépést hajtunk végre 68 ° C-on 10 percig. Az amplifikált PCR-termékeket 1,2% -os etidium-bromidot tartalmazó agarózgéleken futtattuk.

Szövettani elemzés

A máj steatosisának vizsgálatához a májmintákat Tissue-Tek-be (SA-KURA, USA) ágyazta, fagyasztotta és metszette (10 μm), és felhasználásig -80 ° C-on tárolta. A metszeteket hematoxilinnal és olajvörös O-val (Sigma Aldrich, USA) festettük a lipid-lerakódáshoz.

A szövettan szempontjából a zsírszöveteket 10% semleges pufferelt formalinban rögzítettük, majd fokozatos etanollal (80-100%) végzett dehidratálást és paraffinba ágyazást végeztünk. Ezután a szöveteket mikrotóm alkalmazásával 6 μm-es darabokra szeleteltük, xilolban paraffinmentesítettük, 80-100% etanolon átengedtük. A hematoxilin és az eozin (H&E) festését a szokásos technikák alkalmazásával végeztük.

A transzmissziós elektronmikroszkópos (TEM) elemzéshez a máj- és izomszöveteket 1 mm3-es töredékekre vágtuk, és 2,5% glutáraldehidbe foszfátpufferben (0,1 M, pH 7,4) egy éjszakán át, 4 ° C-on merítettük. Ezt követően háromszor 0,1 M foszfátpufferben mostuk őket. Ezután 1% -os ozmium-tetroxiddal (Os04) 0,1 M foszfátpufferben 2 órán át szobahőmérsékleten utólag rögzítettük őket. Ezt követően ismét háromszor öblítettük 0,1 M foszfátpufferrel. A szöveteket dehidratáltuk osztályozott alkoholokon (30, 50, 70, 80, 90, 95 és 100%) 30 percig. Utoljára az Epon 812-be ágyazták. Az Epon-beágyazott minták ultravékony (70-90 nm vastagságú) szakaszait rézrácsokra helyezték, és uranil-acetáttal és ólom-citráttal festették. A metszeteket Hitachi H-7650 típusú elektronmikroszkóppal vizsgáltuk (Hitachi, Japán).

Az enzimaktivitások mérése

A máj és a fehér zsírszövet lipogenezisében szerepet játszó enzimek aktivitásának meghatározásához az enzimforrás frakciót az alábbiak szerint állítottuk elő. Röviden, 10% (w/v) homogenátumot készítettünk foszfáttal pufferolt oldatban (pH 7,2-7,4), majd 2000-3000 fordulat/perc sebességgel 20 percig centrifugáltuk, és a felülúszót új csőbe helyeztük. A mintákat felhasználásig -80 ° C-on tároltuk. Az összes enzimet, mint például a piruvát-dehidrogenáz (PDH), az acetil-CoA-karboxiláz (ACC), az acetil-CoA-karboxiláz-1 (ACC1) és a diacilglicerin-acil-transzferáz-2 (DGAT2), ELISA-méréssel (Jin Ma, Kína).

Intracelluláris kalcium mérés

A fluoreszcens Ca 2+ indikátort, a fura-2-t alkalmaztuk a kalcium változásának nyomon követésére. A HepG2 sejteket Nonenzymatic Cell Dissociation Solution-val (M&C Gene Technology, Kína) gyűjtöttük össze, kétszer Hanks-oldattal mostuk, és 5 × 106 sejt/ml sűrűségben újraszuszpendáltuk 0,025% szarvasmarha-szérum albumint tartalmazó Hanks-féle kiegyensúlyozott sóoldatban. . A sejteket ezután 3 µM Fura-2-AM-mel (Dojindo Laboratories) töltöttük 30 percig 37 ° C-on. A sejteket kétszer Hanks-oldatban mostuk, majd Hanks-oldatban 1 × 107 sejt/ml koncentrációban újraszuszpendáltuk. A sejteket a megadott koncentrációjú niacinnal stimuláltuk, és a Ca 2+ fluxust fluoreszcencia spektrométerben mértük 340 és 380 nm gerjesztési hullámhosszak alkalmazásával.

Western blot elemzés

Statisztikai elemzés és adatfeldolgozás

Állatkísérleteknél n érték jelzi a kohorszonkénti állatok számát. Állatkísérleteknél a mintaméretek korábbi vizsgálatokon és szakértelemen alapultak. A bemutatott sejtek összes adata legalább három független kísérletet reprezentál. Valamennyi eredményt átlag ± SEM-ben fejezzük ki. A statisztikai elemzésekhez a GraphPad Prism 6 szoftvert (San Diego, Kalifornia) használták. A párosítatlan kétfarkú Student t-tesztjét két csoport összehasonlításához használtuk az összes ábrához. A különbségeket akkor tekintettük jelentősnek, amikor P ↵