A fokozott lipid-felhalmozódás gátlása a poli (ADP-ribóz) polimeráz SREBP1 modulációval

Pekingi Geriátriai Intézet, Pekingi Kórház

megnövekedett

No.1 Dahua Road, Peking, 100730 (Kína)

Tel. + 86-10-58115044, Fax + 86-10-65237929, E-mail [email protected]

Kapcsolódó cikkek a következőhöz: "

  • Facebook
  • Twitter
  • LinkedIn
  • Email

Absztrakt

Bevezetés

A poli (ADP-ribóz) polimeráz (PARP) az enzimcsalád tagja, amely részt vesz a DNS károsodásában és helyreállításában. A PARP aktiválható DNS-szál törésekkel, szabálytalan DNS-szerkezetekkel vagy más transzláció utáni módosításokkal [1]. A PARP-aktiváció szabályozhatja a fehérje működését, a kromatin-tömörítést és a génexpressziót azáltal, hogy módosítja a célfehérjéket a poli (ADP-ribosil) -ionon keresztül [2]. A PARP túlaktiválása azonban sejtekrózishoz vezethet a NAD és az ATP kimerülése miatt. A PARP aktiváció, amely védő válasz a DNS károsodására, szintén szerepet játszik a sejtek diszfunkciójában.

A túlzott energiafogyasztás kiválthatja a reaktív oxigéntermékek túltermelését és károsíthatja a biológiai makromolekulákat, ezáltal anyagcsere-diszfunkcióhoz vezethet a 2-es típusú diabetes mellitusban szenvedő betegeknél [3, 4]. A felesleges energiabevitel folyamata során a PARP oxidatív stressz hatására aktiválódik, és glükóz anyagcserezavarokkal társul. A PARP1 deléció növeli a mitokondriális bioszintézist és megakadályozza a magas zsírtartalmú étrend által kiváltott inzulinrezisztenciát az elhízott egerek NAD + -tartalmának és SIRT1-aktivitásának növelésével [5]. A PARP inhibitor a NAD-SIRT1 modulációval javítja a májsejtek inzulinérzékenységét. Ennek megfelelően a PARP gátlás pozitív szerepet játszik a glükóz metabolizmusában. Mindazonáltal a PARP inhibitorok hatása a lipid metabolizmusra továbbra is megfoghatatlan.

A PARP1 gén delécióról beszámoltak arról, hogy fokozza a máj lipidfelhalmozódását és súlyosbítja a magas zsír által kiváltott elhízást [6]. A PARP jótékony funkciója károsodhat, ha a PARP1 gént töröljük. Ezért az aktivált PARP részleges gátlását érdemes megvizsgálni a metabolikus diszfunkciós terápia szempontjából. Sürgősen ki kell deríteni, hogy a PARP inhibitorok azonos hatást gyakorolnak-e a lipid anyagcserére a PARP1 gén deléciójával vagy sem.

A PARP inhibitorok lipid metabolizmusra gyakorolt ​​hatásának értékeléséhez az olajsavval kezelt májsejteket PJ34-vel kezeltük, az egér modelleket pedig magas zsírtartalmú étrenddel etettük. Az eredmények kihatással vannak a PARP inhibitorok klinikai alkalmazására a metabolikus betegségek kezelésében.

Anyagok és metódusok

Sejtkultúra

Az American Type Culture Collection-től kapott egér hepatoma HEP1-6 sejteket 25 mM glükózt tartalmazó, 10% magzati szarvasmarha-szérummal kiegészített DMEM-ben (Invitrogen, Grand Island, NY) tenyésztettük (Biowest, Franciaország). A sejteket 37 ° C-on növesztettük, 5% CO2-nedvesített légkörben. A magas zsírtartalmú kezelés érdekében a sejteket 500 µM olajsavval (OA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) vagy BSA-val (kontroll) kezeltük 3 µM PJ34-el vagy anélkül 48 órán keresztül.

Western blottolás

A fehérjemintákat (60 ug, Bio-Rad assay-vel meghatározva, Thermo, Rockford, IL, USA) 9% -os nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézissel választottuk el. Az anti-poli (ADP-ribóz) polimert (PAR, Trevigen, Gaithersburg, MD), a SREBP1 (SANTA CRUZ Biotechnology, CA) és az anti-aktin antitesteket egy éjszakán át inkubáltuk 4 ° C-on. Aktint használtunk kontrollként a fehérjék egyenlő terhelésének igazolására.

Kvantitatív valós idejű PCR

A teljes RNS-t a májszövetből vagy sejtekből extraháltuk Trizol (Invitrogen, Frederick, MD, USA) alkalmazásával, és a cDNS-t szintetizáltuk 2 ug teljes RNS-ből M-MLV reverz transzkriptáz (Invitrogen) alkalmazásával. A valós idejű PCR-t SYBR Green Master Mix Kit alkalmazásával hajtottuk végre egy Lightcyclerben (iQ5, Bio-rad, USA). PCR primereket állítottunk elő Srebp1a, Srebp1c, Srebp2, Chrebp és Lxrα esetében az egér gén régióinak publikált nukleotid szekvenciái alapján (1. táblázat). A Hprt belső kontroll génként szolgált.

Asztal 1.

A valós idejű PCR-hez használt primerek szekvenciája

Olajvörös O festés

A májszöveteket 4% paraformaldehidben rögzítettük és 10 μm-es szeletekre vágtuk kriosztát segítségével (Leica CM3050S, Németország). A tárgylemezeket 0,5% olajvörös O-val (Sigma-Aldrich) izopropanolban 30 percig festettük, majd 60% izopropanolban és desztillált vízben öblítettük. A tárgylemezeket glicerinnel lezártuk és lefényképeztük.

Immunrecipitation (IP) assay

A sejt lizátumokat egy éjszakán át 4 ° C-on inkubáltuk vagy anti-Sp1 antitesttel, vagy normális nyúl IgG-vel, majd 4 ° C-on 4 órán át protein-A + G agarózt (Beyotime, Kína) adtunk hozzá. Az immunprecipitátumokat centrifugálással ülepítettük és négyszer lízispufferrel mostuk. Ezután az immunprecipitált mintákat SDS mintapufferben melegítettük, és SDS-PAGE analízishez használtuk. Nem specifikus IgG-t használtunk negatív kontrollként.

Chromatin immunprecipitációs (ChIP) teszt

A ChIP kísérleteket a Chip assay kit (Beyotime, Kína) használati útmutatójaként hajtottuk végre. A Hep1-6 sejteket ultrahanggal kezeltük és immunprecipitáltuk 4 ug Sp1 antitest (Abcam, Cambridge, MA) vagy IgG alkalmazásával. A nyírt DNS-t DNS-extraháló készlettel tisztítottuk, és kvantitatív valós idejű PCR-analízissel amplifikáltuk. A srebf1 promoter primer szekvenciái az 5’-CCA TCC CTG GCC CTT TAA TCT AAC GA-3 ’(érzék) és az 5’-TTC GGA CTA GGC CCA CGT TAA GGA AA-3’ (anti-érzék) voltak.

Állatok és étrend

A hím C57BL/6 egereket (hat-nyolc hetesek) normál zsírtartalmú étrenddel vagy magas zsírtartalmú étrenddel (D12492, Huafukang, Kína) ad libitummal etettük 3 hónapig (2. táblázat). Testtömegüket hetente ellenőrizték. 3 hónap elteltével az egereket négy csoportra osztották (csoportonként hat egér): (1) normál zsírtartalmú étrendes egerek; (2) normál zsírtartalmú diétás egerek, 30 mg/kg PJ34 (Sigma – Aldrich, St. Louis, MO, USA) intraperitoneális injekciókat kapnak naponta egyszer, két héten keresztül; (3) magas zsírtartalmú diétás egerek; (4) magas zsírtartalmú diétás egerek, akik PJ34-kezelést kapnak (ugyanaz, mint a 2. csoportban). Ezeket a protokollokat a pekingi normál egyetem helyi állatetikai bizottsága felülvizsgálta és jóváhagyta.

2. táblázat.

A kísérleti étrendek összetétele

Intraperitoneális glükóz tolerancia teszt (IpGTT)

A 3 hónapos magas zsírtartalmú etetés végén az összes egér glükóz tolerancia teszten esett át; és két hétig tartó PJ34 kezelés után megismételtük a glükóz tolerancia tesztet. Az egereket egy éjszakán át éheztettük, majd 2 g glükóz/testtömeg-kg intraperitoneális injekciót kaptunk. Az eljárás megegyezett a korábban leírtakkal [7].

Intraperitoneális inzulin tolerancia teszt (IpITT)

4 órás éhgyomorra után az egereknek intraperitoneális injekciót adtak 0,5 U inzulin/testtömeg-kg-ban. A glükózt a farok hegyéből vett vérmintákból mértük 15, 30, 60 és 120 perces időközönként. Az egerek inzulin tolerancia tesztet kaptak mind a PJ34 beadása előtt, mind után.

Vérminták és szövetgyűjtés

Az egereket egy éjszakán át éheztettük és pentobarbitál-nátriummal altattuk. Az eutanázia után teljes vért gyűjtöttünk a szív jobb kamrájának szúrásával. A szérumot centrifugálással izoláltuk, és –80 ° C-on tároltuk. A szöveteket eltávolítottuk, lemértük és –80 ° C-on tároltuk. A triglicerideket (TG), az összes koleszterint (TC), a nagy sűrűségű lipoprotein koleszterint (HDL) és az alacsony sűrűségű lipoprotein koleszterint (LDL) automatikus analizátorral (Hitachi, 7600, 7170A) mértük.

Inzulin és inzulinérzékenységi indexek

A szérum inzulint kereskedelmi enzimmel kapcsolt immunszorbens assay (ELISA) készlettel (Alpco Diagnostics, Salem, NH, USA) vizsgáltuk a gyártó utasításainak megfelelően. Az inzulinrezisztenciát számos mutatóval értékelték [8]. Az alkalmazott képleteket az alábbiakban mutatjuk be:

HOMA-IR = (FBI (µU/ml) × FBG (mmol/L))/22,5

QUICKI = 1/(Log (FBG mg/dL) + log (FBI µU/ml))

HOMA-IR: Homeosztatikus modell értékelése - inzulinrezisztencia; QUICKI: kvantitatív inzulinérzékenység-ellenőrző index; FBI: éhomi vérinzulin; FBG: éhomi vércukorszint.

Statisztikai analízis

Az adatokat az átlag ± a szórás (SD) vagy az átlag ± az átlag standard hiba (SEM) formájában fejezzük ki. Két átlagérték összehasonlítását független minták t-teszttel végeztük. A különböző adatcsoportok közötti többszörös összehasonlításhoz szignifikáns különbségeket határoztak meg az SPSS szoftver egyirányú ANOVA alkalmazásával. Az időbeli különbségek teszteléséhez egyirányú, ismételt ANOVA-mérést alkalmaztunk post-hoc tesztekkel. Az értékek közötti különbségeket szignifikánsnak tekintették P-nél