A magnetoszómaláncok rendellenes mágneses orientációi egy magnetotaktikus baktériumban: Magnetovibrio blakemorei MV-1 törzs

Kémia és Kémiai Biológia Tanszék, McMaster Egyetem, Hamilton, Ontario, Kanada

Hírek School of Life Sciences, Nevada Egyetem, Las Vegas, Las Vegas, Nevada, Amerikai Egyesült Államok

Kémia és Kémiai Biológia Tanszék, McMaster Egyetem, Hamilton, Ontario, Kanada

Samanbir S. Kalirai,
Dennis A. Bazylinski,
Adam P. Hitchcock

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Kalirai SS, Bazylinski DA, Hitchcock AP (2013) A magnetoszóma láncainak anomális mágneses orientációi egy magnetotaktikus baktériumban: Magnetovibrio blakemorei MV-1 törzs. PLoS ONE 8 (1): e53368. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0053368

Szerkesztő: Josh Neufeld, a Waterloo Egyetem, Kanada

Fogadott: 2012. szeptember 1 .; Elfogadott: 2012. november 30 .; Közzétett: 2013. január 8

Finanszírozás: A CLS-t a Kanadai Alapítvány az Innovációért (CFI), az NSERC, a Kanadai Egészségügyi Kutatási Intézetek (CIHR), a Nemzeti Kutatási Tanács (NRC) és a Saskatchewani Egyetem támogatja. A DAB-ot az U. S. National Science Foundation (NSF) EAR-0920718 támogatása támogatja. Az ALS-t az amerikai Energiaügyi Minisztérium Anyagtudományi Osztályának Energetikai Kutatások Irodájának Energetikai Kutatási Irodájának igazgatója támogatja a DE-AC02-05CH11231 sz. Szerződés alapján. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

A magnetotaktikus baktériumok (MTB) mindenütt jelen vannak tengeri és édesvízi környezetben [1], [2], [3]. Filogenetikailag és morfológiailag változatos csoportot alkotnak, amelyeket összekapcsol az a képesség, hogy biomineralizálják a membránnal kötött mágneses nanorészecskéket, az úgynevezett magnetoszómákat. A magnetoszómák vagy magnetit, Fe3O4 vagy greigit, Fe3S4 [4] egydoménes mágneses kristályai, amelyek jellemzően egy vagy több láncban vannak orientálva. A magnetoszómák felelősek a magnetotaxis nevű viselkedésért, amelyben a sejtek passzívan igazodnak és úsznak a Föld geomágneses mező vonalai mentén, amelyek ferdeek, kivéve az Egyenlítőnél [5]. A háromdimenziós keresési probléma egyetlen dimenziósá történő csökkentésével a magnetotaxis lehetővé teszi a mozgékony baktériumok számára, hogy hatékonyabban megtalálják és fenntartsák helyzetüket az optimális kémiai környezetben, általában az oxikus-anoxikus határfelületen, a vízi élőhelyeken, amelyekre függőleges kémiai jellemzők jellemzőek (pl. oxigén) koncentráció gradiensek [5]. Kémiailag rétegzett élőhelyeken tehát úgy tűnik, hogy az MTB-nek jelentős előnye van a nem magnetotaktikus baktériumokkal szemben előnyös környezetük elhelyezkedésében [6].

A mágnestermelő MTB szintetizálja az általában szorosan elhelyezkedő, koherensen illeszkedő magnetoszómák mágnesezett láncait, hogy maximalizálja a dipólus kölcsönhatását a Föld mágneses mezőjével [7], [8], [9]. A nagy kémiai tisztaságú, szoros méreteloszlású és egyenletes alakú magnetoszóma magnetitkristályok reprodukálható előállításának képessége a biomineralizáció tökéletes folyamatát jelenti [10], [11]. A magnetoszóma kristályok méreteloszlását szigorúan ellenőrzik, hogy az egydoménes méretrendszeren belül legyen [11], ezáltal maximalizálva az egyes magnetoszómák egyedi dipólusmomentumát, és megakadályozva az olyan káros mérettől függő hatásokat, mint a szuperparamágnesesség és a többszörös doménképződés, amelyek kiküszöbölik vagy csökkentik a hatékonyságot a mágneses részecske.

Nagy az érdeklődés a biomineralizáció és a kapcsolódó folyamatok megértése iránt, mind alapvető szempontból, mind a biomimetikai alkalmazások iránt [12], [13]. Így röviddel a magnetotaktikus baktériumok kezdeti felfedezése [14] [15] után hatalmas erőfeszítések kezdődtek a jelenség mélyebb megértése érdekében, és ez még ma is folyamatban van. A magnetoszóma biomineralizációjának megértése érdekében tett erőfeszítések nagy része genetikai technikákat tartalmazott, amelyek nemcsak a magnetoszómák felépítésében, kialakulásában és szerveződésében szerepet játszó gének felfedezését eredményezték (a mam, az mms és az mtx gének), hanem azt is, hogy megállapították, hogy ezen gének többsége a genomban lévő klaszterekként helyezkednek el, amelyek tovább magnetoszóma génszigetként szerveződnek [16]. Olyan technikákat alkalmaztak, mint a transzmissziós elektronmikroszkópia (TEM), hogy kitöltsék azokat a tudáshiányokat, amelyek összefüggenek az egyes mam-gének szerepének megértésével, valamint a lánc növekedésének és az egyes magnetoszómák közötti interakciók általános megértésével egy láncban [17].

Itt egy olyan tanulmányról számolunk be, amely pásztázó transzmissziós röntgen mikroszkóppal (STXM) [23] - [25] és röntgen mágneses körkörös dikroizmussal (XMCD) [26] határozza meg a magnetoszóma láncok mágneses és kémiai tulajdonságait az egyes sejtekben. a magnetotaktikus baktérium, a Magnetovibrio blakemorei MV-1 [27] törzs az egyes magnetoszómák szintjén [28], [29]. Míg a legtöbb korábbi tanulmány a rendszeresen elosztott magnetoszómákkal rendelkező láncokra összpontosított, amelyekben az egyes magnetoszómák mágneses vektora ugyanabba az irányba illeszkedik, mint a lánc összes többi magnetoszómája, addig azokra a sejtekre összpontosítottunk, amelyek térbeli elkülönítéssel alláncokat tartalmaznak rések. Az MV-1-et modellszervezetnek választották, mivel ezekben a sejtekben korábban megfigyelték a magnetoszóma részláncai közötti térbeli réseket [7], [30]. STXM-XMCD eredményeink azt mutatják, hogy az eddig vizsgált magnetoszóma láncok többségétől eltérően az MV-1 réseivel elválasztott részláncoknak ellentétes mágneses orientációja lehet. A térbeli hézagokat olyan résekként definiáljuk, amelyek nagyobbak, mint 50 nm, ami sokkal nagyobb, mint a kondenzált láncok tipikus magnetoszóma-elválasztási távolságai. Ezeknek az eseteknek a vizsgálata további betekintést nyújt a láncképződés mechanizmusaiba.

Kísérleti

STXM-XMCD mérések

Ezenkívül beszerezhetünk mágnesesen érzékeny XMCD térképeket, amelyek az egyes polarizációknál egyetlen, mágnesesen érzékeny fotonenergián rögzített képek különbségei. 708,2 eV fotonenergia, az XMCD spektrum első minimumának energiája biztosítja a maximális mágneses érzékenységet a magnetit esetében.

Magnetotaktikus baktériumok előállítása

A vizsgált magnetotaktikus baktérium, a Magnetovibrio blakemorei MV-1 törzs sejtjeit anaerob módon tenyésztettük folyékony tenyészetekben, dinitrogén-oxiddal, mint terminális elektron akceptorral, az előzőekben leírtak szerint [34]. A sejteket a tenyészetekből gyűjtöttük a növekedés közepes és késői exponenciális szakaszában.

Transzmissziós elektronmikroszkópia

A sejteket standard formvar bevonattal ellátott réz elektronmikroszkóp rácsokra helyeztük, mossuk a tenyészsók eltávolítása céljából, és JEOL JEM 1200 EX típusú transzmissziós elektronmikroszkóppal nézzük meg.

Eredmények

A képet 709,8 eV frekvencián rögzítettük és optikai sűrűséggé (OD) alakítottuk át, a kép sejtjei nélküli területek intenzitásának felhasználásával. A nyilak jelzik azokat a sejteket, amelyek magnetoszómaláncaikban látszólagos rések vannak. A kérdőjelek (piros) olyan (több) sejtet jeleznek, amelyeket diszkontáltak a jelenlévő sejtek és/vagy magnetoszóma láncok számának bizonytalansága miatt.

E 351 sejt 150 sejtből álló részhalmazából, amelyhez az XMCD-t mértük, 6 sejt volt, amelyek két vagy több, egymással ellentétes mágneses polaritású magnetoszómák részláncát tartalmazták, aminek eredményeként a mágneses anomáliák gyakorisága a teljes sejt 4,0 ± 0,2% -a volt. populációt, és 9,9 ± 0,4% -os gyakoriságot mutat azoknak a sejteknek, amelyeknek magnetoszómalánc-hiánya van. A mágneses anomáliák olyan magnetoszóma láncok, amelyek legalább egy magnetoszóma méretű réssel rendelkeznek a láncban (> 50 nm), és a rés ellentétes mágneses irányú részláncokat választ el.

2a. Ábra egyetlen MV-1 sejtet mutat, amely a magnetoszómák jellegzetes megszakított láncát tartalmazza. A 2b. És 2c. Ábra a két láncszakasz Fe2p3/2 röntgenabszorpciós spektrumát és a hozzájuk kapcsolódó XMCD jeleket mutatja be. A spektrális jelek azt mutatják, hogy az egyik mágneses jele inverz a másikhoz. A 2d. Ábra az XMCD jelek színkódolt összetételét mutatja be a celluláris anyagéval, amelyet 704 eV-nál vizualizálunk, a Fe 2p él kezdete alatt. Ez az előadás egyértelműen megmutatja, hogy a bal oldali láncszakasz mágneses iránya ellentétes a jobb oldali láncszakasszal. Két különálló láncú sejt egymásra helyezése kizárt az él előtti átlagos kép miatt (kék a 2d. Ábrán), amely érzékeny a sejtsűrűségre. Ha két cella kerül egymásra ezen a képen, akkor a kereszteződés előtti jel szembetűnően nagyobb lenne, mint a lánc végén, ahol a kép egyértelműen egy-egy sejt képe.

a) STXM kép (OD). A két alláncot 1. és 2. lánccal jelöltük. Mindegyik magnetoszómát a-g jelzéssel láttuk el. (b) A bal lánc (felső) és a jobb lánc (alsó) Fe 2p3/2 spektruma a két kör alakú polarizációval rögzítve. (c) A két körpolarizációs spektrum kivonásával nyert XMCD jelek. (d) A sejt színkódolt kompozitja (OD kép 704 eV-nél) (kék), magnetoszómák balra polarizálódva (zöld) és jobbra polarizálódva (piros). Az (a) és (d) ábrán látható nyilak „előmagnetoszómát” jeleznek - lásd a szöveget.

Két magnetoszóma részlánc közötti rés Fe 2p3/2 spektruma (piros); egy éretlen, esetleg szuper paramágneses, magnetoszóma kristályé (zöld); a sejt citoplazma (kék) és az egyetlen magnetoszóma (narancs )ét hasonlítják össze 3. ábra. Ez az összehasonlítás azt mutatja, hogy több vas van a résen belül, mint a sejtnek a magnetoszóma láncán kívüli részeiben. Ezenkívül a résen belül a vas spektrális alakja különbözik az érett és éretlen magnetoszóma magnetit kristályokétól. A ∼708 eV és ∼710 eV jelek hagyományosan a Fe (II) és a Fe (III) oxidációs állapotokkal társulnak (bár a tiszta Fe (II) és tiszta Fe (III) fajok spektrumai tartalmaznak valamilyen jelet minden egyes energiánál). A rés területe nagyobb Fe (II) tartalmat mutat, mint az érett magnetoszóma kristályé. Az érett magnetoszóma kristályok Fe 2p3/2 spektruma jól egyezik a referencia magnetit spektrumával [29]. Az éretlen magnetoszóma kristály Fe 2p3/2 spektruma hasonló az érett kristályéhoz, de nem mágneses (nulla XMCD).

(b) Fe 2p3/2 spektrumok (a bal és jobb kör alakú polarizációs adatok átlaga) a sejt különböző régióiban: egyetlen magnetoszóma (piros), az első rés (rózsaszín), az „előmagnetoszóma” (zöld) és a sejt citoplazmája (kék) a magnetoszóma lánctól távol. (c) A rés kitágulása és a pre-magnetoszóma spektrumok. A függőleges vonalak olyan energiákat jeleznek, amelyek hagyományosan társulnak a Fe (II) és a Fe (III) oxidációs állapot jeleihez.

4. ábraaz a egy teljes intakt MV-1 sejt TEM képét mutatja, míg a 4b. ábra ugyanazon sejt megfelelő STXM képe 709,8 eV mellett. Három magnetoszóma részlánc található ebben a sejtben, közöttük hézagokkal. A három allánc XMCD-térképe (4c. Ábra) azt mutatja, hogy az 1. és a 2. és 3. lánc között ellentétes mágneses orientáció van. Ez a három allánc XMCD-spektrumának ellentétes értelmében tükröződik (4d. Ábra). ). Átlagosan az 1. lánc XMCD-jele nagyobb, mint a 2. és 3. láncé.

a) A sejt TEM képe. A téglalap alakú sötét tárgyak a növekedési közeg sókristályai. A szaggatott fehér vonal a 3 alláncot tartalmazó sejt határát jelzi. (b) STXM-kép 709,8 eV-nál az azonos régióról. (c) A magnetoszóma lánc XMCD jelének színkódolt összetettje. (d) A 3 részlánc XMCD spektrumai.

Vita

A 3c. Ábra azt mutatja, hogy a vasfajok eloszlása a résben több vas-, Fe (II) -tartalommal rendelkezik, mint a magnetit. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a magnetoszóma vezikulákba biogén magnetit képződéséhez szállított vas formája vas jellegű [35], [36], [37]. Bármely vas vasszállítás valószínűleg szideroforokat von maga után, megakadályozva a Fe (III) kicsapódását [38]. Frankel és mtsai. [37] 57 Fe Mössbauer spektroszkópiával vizsgálta a fő vasvegyületek természetét és eloszlását az M. magnetotacticumban. Javasolták azt a modellt, amelyben a Fe (III) -ot a sejt nem specifikus eszközökkel veszi fel, a sejtbe jutva Fe (II) -né redukálja, majd a magnetoszómák képződése során újra oxidálódik Fe (III) -oxiddá. az a tény, hogy a résen található Fe 2p3/2 spektrális aláírás vaskosabb jellegű, mint a magnetoszómák, összhangban áll ezzel a felfogással. Ez a vasjel egy magnetoszóma vezikulumból származhat, amely vagy nem képes kicsapni a magnetitet, vagy éppen a magnetit képződése előtt van.

Az egyik lehetőség, amely megmagyarázhatja a megfigyelést, az, hogy az anomális sejtek magas külső mágneses teret tapasztaltak, amely megfordította a részleges lánc egyik felének mágneses orientációját, anélkül, hogy befolyásolta volna a másik felét. Ez nagyon valószínűtlen, mivel nagy, síkban elhelyezkedő mágneses mezőre (~ 6,37 × 10 4 A/m) van szükség az egydoménes magnetitkristály nyomatékának megfordításához [9]. Ha a mintát ekkora külső mezőknek tennék ki, akkor azt várnánk, hogy mindkét allánc hasonló hatással lesz. A második lehetőség az, hogy a magnetoszóma láncot befolyásolta az ellentétesen orientált lánc mezője egy sejtben, amely közel került egymáshoz. A sejten kívüli magnetoszóma lánc által létrehozott mező azonban túl gyenge ahhoz, hogy módosítsa a szomszédos sejt belsejében lévő magnetoszómák mágnesezettségét, mivel az intracelluláris láncok nagy mezője és a mágneses tér erősségének gyors csökkenése növekszik a távolsággal. Korábban 1,90 × 10 3 - 2,85 × 10 3 A/m kényszerterület-erősségre volt szükség a 15 magnetoszómából álló MV-1 lánc polaritásának átállításához [7]. Ez azonban változhat, mivel a magnetoszóma láncok kényszerterületei a lánc hosszának, a részecskék közötti távolságnak és a magnetoszómák méretének függvényei [40].

A távolságokat a 2a. És 4b. Ábrán látható képek alapján számoltuk ki. A 2a. Ábra bal és jobb oldali réseinek távolsága 107 ± 8 nm és 96 ± 8 nm (a minta dőléséből adódó előrövidülést figyelembe vettük). A 4b. Ábra esetében a balról jobbra való távolság 150 ± 7 nm, 46 ± 13 nm és 242 ± 17 nm. Az egyszerű pontmágnesezési modell alapján végzett számításokat a 2a. Ábrán látható láncbeállítással hajtottuk végre. Az MV-1 cellában lévő 15 magnetoszómából álló lánc mágneses momentumát az elektron-holográfiai mérések alapján 7,1 × 10 −16 Am 2 értékre számítottuk [7]. Ezen eredmény alapján az átlagos magnetoszóma mágneses momentum a becslések szerint 4,5 × 10 −17 Am 2 lesz a 2. ábra 4 magnetoszómájának mindegyikénél. A szomszédos 4-magnetoszóma lánctól a 2. lánc „magnetoszómájánál” lévő mező megközelítőleg 5,5 × 104 A/m a kísérletileg meghatározott momentuma irányába. Az „magnetoszóma f” jelenléte nélkül a magnetoszómán a mező ~ 4,4 × 10 3 A/m lenne a pillanat ellentétes irányában. Megfelelően orientált magnetoszóma hiányában ennek a mezőnek elég erősnek kell lennie ahhoz, hogy a magnetoszómák mágneses hiszterézisére vonatkozó korábbi tanulmányok szerint átirányítsa a „magnetoszómát e” [7].

Komeili és mtsai. [21] és Scheffel és mtsai. [20] kimutatta, hogy a Magnetospirillum faj sejtjeiben a magnetoszómákat a rostos aktinszerű fehérje, a MamK lokalizálja és állítja össze, amely úgy tűnik, hogy a prokarióta citoszkeleton alkotja a magnetoszóma láncának stabilitását. Egy savas magnetoszóma membránfehérje nyilvánvalóan felelős a magnetoszóma MamK-hoz való lehorgonyzásáért [20]. Ezenkívül úgy gondolják, hogy a magnetoszómák részben mágneses interakciók révén aggregálódnak [20]. A Magnetovibrio blakemorei sejtjei tartalmaznak egy mamK gént a genomjukban, de a mamJ-t nem. Ez arra utalhat, hogy a magnetoszóma-lánc képződésének mechanizmusa kissé eltér a Magnetovibrio blakemorei-ban a Magnetospirillum fajokétól, és ez lehet az oka a magnetoszómák közötti réseknek az MV-1-ben.

Az ellentétes mágneses orientációjú magnetoszóma részláncú sejtek frekvenciája alacsony. Statisztikai elemzésünk az összes sejt 4,0% -át, és a hiányt tartalmazó sejtek 9,9% -át mutatja. Mivel azonban az XMCD kísérlet csak a vízszintesen orientált láncokról ad mágneses információkat (az XMCD intenzitása a vízszintestől való eltérés koszinuszával csökken), a frekvenciánk valószínűleg alulbecsült. Becslésünk szerint az XMCD jel csak akkor figyelhető meg, ha a lánc vízszintes ± 20 ° -on belül van ezen csillapítás és méréseink statisztikai határai miatt. Ezt a tényezőt figyelembe véve a jelenség becsült gyakorisága az MV-1 esetében 4,0 ± 0,2% -ról 18,0 ± 0,9% -ra nő az MV-1 teljes populációjának figyelembevételével, és 9,9 ± 0,4% -ról 44,6 ± 1,8% -ra az MV-1 esetében. -1 sejt, hézagokat tartalmazó magnetoszóma láncokkal. Végül nem ismert, hogy az MV-1 sejtekben a természetben vannak-e hézagok a magnetoszómák és/vagy a magnetoszóma láncok között, és ezáltal ellentétes mágneses orientációjú láncok vannak-e. Ez azért fontos, mert jelenleg nem zárhatjuk ki annak lehetőségét, hogy a hiányosságok a növekedési viszonyok és/vagy a növekedési ütem miatt műtárgyak. További növekedési kísérletekre, valamint a nem tenyésztett, vad minták megfigyelésére van szükség ennek a lehetőségnek a vizsgálatához.

Következtetések

Megmutattuk, hogy a Magnetovibrio blakemorei egyes sejtjei, amelyek térbeli résekkel elválasztva tartalmazzák a magnetoszóma részláncokat, rendellenes mágneses orientációt mutatnak. Kimutatták, hogy ennek gyakorisága az összes sejt legalább 4,0% -a, és hiányos sejtek 9,9% -a. A tényleges gyakoriság valószínűleg jóval magasabb, figyelembe véve a méréseink jellegét. Valamennyi megfigyelt irányváltási eset egy réshez kapcsolódik, ami azt sugallja, hogy az alláncok anomális orientációja a hiányosságokkal elválasztott alláncok közötti elégtelen magnetosztatikus kölcsönhatások miatt következik be.

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük több névtelen áttekintőnek, hogy nagyon hasznos megjegyzéseket és információkat nyújtottak, különös tekintettel a fejlődő magnetotaktikus baktériumokra ható mágnesező erőkre. Köszönjük Dr. Jian Wang és Chithra Karunakaran a kanadai fényforrás (CLS) szakértői támogatásáért és Dr. Tolek Tyliszczak az STXM készülékek szakértői támogatásáért az Advanced Light Source (ALS) és a CLS területén. Az XMCD vizsgálatok többségét az STXM-n végezték a 10ID1 gerenda vonalon a CLS-nél. Ábrán látható példa. A 4-et az STXM-en mértük az ALS 11.0.2-es sugárvonalán.

Szerző közreműködései

A kísérletek kidolgozása és megtervezése: SSK APH DAB. Végezte el a kísérleteket: SSK APH. Elemezte az adatokat: SSK. Hozzájáruló reagensek/anyagok/elemző eszközök: DAB APH. Írta az írást: SSK DAB APH.