A magas zsírtartalmú étrend okozta rendellenességek hatása az endometrium hiperpláziával és az Adiponectin rendszerrel rendelkező patkányok körében és a méhben

Chen-Guang Shang

Szülészeti és Nőgyógyászati Osztály, Pekingi Egyetem Első Kórház, Peking 100034, Kína

Zhao-Hui Liu

Szülészeti és Nőgyógyászati Osztály, Pekingi Egyetem Első Kórház, Peking 100034, Kína

Xiao-Hui Wang

Szülészeti és Nőgyógyászati Osztály, Pekingi Egyetem Első Kórház, Peking 100034, Kína

Zong-Hao Feng

Szülészeti és Nőgyógyászati Osztály, Pekingi Egyetem Első Kórház, Peking 100034, Kína

Yan Zhang

Szülészeti és Nőgyógyászati Osztály, Pekingi Egyetem Első Kórház, Peking 100034, Kína

Absztrakt

Háttér:

Az epidemiológiai és genetikai vizsgálatok összefüggést sugallnak az inzulinrezisztencia (IR) és az endometrium rák között, és az endometrium hyperplasia (EH) az endometrium rákja előtti stádium. Az adiponektin egy olyan adipokin, amely korábban az endometrium rák rizikófaktorának bizonyult. A vizsgálat célja az IR és EH patkánymodelljének kidolgozása, valamint a keringésben és a méhben lévő adiponektin rendszer értékelése volt.

Mód:

Ez a vizsgálat egy 46 hetes állatkísérlet volt 2014 februárjától 2015 januárjáig. A női Sprague-Dawley patkányokat 40 hétig magas zsírtartalmú étrenddel (HFD) etették, hogy IR-t indukáljanak. Az ovariectomizáció után a patkányokat orálisan adtuk 17 p-ösztradiolhoz (E2) 4 hétig az EH indukálására, majd felöltük őket. Összesen 36 patkányt osztottak négy csoportba: E2, HFD, HFD + E2 és kontroll csoportokba. Az adatokat Student-féle t-teszttel, egyirányú varianciaanalízissel (ANOVA) és Mann-Whitney U-tesztekkel elemeztük. Khi-négyzetet használtunk az immunhisztokémia pontszámának értékelésére.

Eredmények:

A HFD-E2 csoportban az endometrium, a mirigyes hám és a myometrium vastagsága magasabb volt, mint az E2 csoporté (F = 59,02, F = 23,51, illetve F = 12,53, az összes P Kulcsszó: Adiponectin, Adiponectin receptorok, ösztradiol, inzulinrezisztencia

BEVEZETÉS

Ebben a tanulmányban egy patkánymodellt építettünk fel IR-val és EH-val, és elemezni kívántuk a magas zsírtartalmú étrend (HFD) és az ösztrogénkezelés után a patkány méhében kiváltott morfológiai hatásokat. Megfigyeltük a plazma adiponectin szintjének változását és meghatároztuk a méh adiponektin és receptorainak expresszióját patkány modellben.

M ETHODS

Etikai jóváhagyás

Ebben a vizsgálatban az állati protokollt a Pekingi Egyetemi Első Kórház (J201305 sz.) Felülvizsgálta és jóváhagyta. A laboratóriumi állatok használatára és gondozására vonatkozó irányelveket a Kínai Nemzeti Egészségügyi és Orvosi Kutatási Tanács iránymutatásainak megfelelően követték.

Állatok

Megvásároltuk a 8 hetes nőstény Sprague-Dawley patkányokat (Vital River Laboratory Animal Co. Ltd., Peking, Kína, engedélyszám: SCXK [Peking] -2012-0001), és a kezelés után 46 héttel felöltünk. Az állatokat szabadon hozzáférhettük az élelemhez és a vízhez, és szabványosított körülmények között (szobahőmérséklet, 23 ° C ± 2 ° C; relatív páratartalom, 50% ± 5%; gyakori szellőzés; 12 órás megvilágítás/12 h sötét).

Az inzulinrezisztencia és az endometrium hiperplázia patkánymodellje

Kísérleti csoportok

1 hetes akklimatizációs periódus után összesen 36 patkányt véletlenszerűen négy csoportra osztottak (n = 9 csoportonként): (1) a HFD-E2 csoportot HFD-vel és OVX-vel etették, majd E2-vel adták be; (2) az E2 csoportot StD-vel és OVX-vel etettük, majd E2-vel adtuk be; (3) a HFD csoportot HFD-vel és OVX-vel etettük, majd vivőanyaggal (olívaolaj) adtuk be; és (4) a kontrollcsoport StD-t és ál-OVX-t kapott, majd vivőanyaggal beadva. StD-vel vagy HFD-vel etetve 40 hétig, az állatok ál-OVX vagy OVX állatok voltak, és 1 héten át gyógyultak. A patkányokat 4 hétig vivőanyaggal vagy E2-vel való beadás után leöltük. A testtömegeket és a táplálékfelvételt kéthetente rögzítettük. A kísérlet végén az összes állatot 12 órán át megfosztották az élelemtől, majd altatták. A méheket eltávolítottuk és levágtuk, majd lemértük (méh nedves súlya). Ezután a méheket nedvesített szűrőpapír közé helyeztük, óvatosan megnyomtuk a luminális folyadék eltávolításához, és újra lemértük (méhfolt súlya). A méh szarvának egy szegmensét 10% -os idegi puffer formalinban rögzítettük 24 órán át, fokozatmentes etanol sorozatban dehidratáltuk, xilolban tisztítottuk és paraffinba ágyazottuk. Az 5 μm-es méhszekciókat rutinszerűen hematoxilin- és eozinfestéssel festették.

Biokémiai vizsgálatok

A plazma adiponektin meghatározásához vérmintákat gyűjtöttünk a hasi aortából heparint tartalmazó csövek segítségével, majd 3000 × g-vel 10 percig centrifugáltuk és -80 ° C-on tároltuk a mérések elvégzéséig. A plazma adiponektin szintjét egy kereskedelemben kapható enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálati készlettel (R&D System, Minneapolis, USA) határoztuk meg a gyártó utasításainak megfelelően. A vizsgálat kimutatási tartománya 0,2-10,0 ng/ml, az érzékenység 0,023 ng/ml volt. Az intra- és inter-assay variációs együtthatók −ΔΔCt) voltak, és a kontrollhoz viszonyított szeres változásként fejezték ki.

Immunhisztokémia

Immunhisztokémiai analízist végeztünk az adiponektin rendszer fehérje expressziójának kimutatására. A soros 3 μm-es méhszekciókat paraffinizáltuk, rehidratáltuk és 10 percig inkubáltuk 3% H2O2-t tartalmazó metanolban. Az antigén visszanyerését háztartási nyomáson 2,5 percig, maximális nyomáson, 0,01 mol/l citrátpufferrel (pH 6,0) végeztük. A normál kecskeszérumban 1 órán át szobahőmérsékleten végzett inkubálás után a metszeteket primer anti-adiponektinnel (1: 250, Abcam, Egyesült Királyság), anti-adiponectin receptor 1-vel (1: 250 arányban hígítva, Abcam, Egyesült Királyság), anti-adiponectinnel inkubáltuk. receptor 2 (1: 250, Abcam, UK) antitest egy éjszakán át 4 ° C-on. Primer antitesteket használtunk 1: 250 arányban. Az immunhisztokémiát egy sztreptavidin/peroxidáz készlet alkalmazásával végeztük a kézirat protokolljának megfelelően (ZSGB-BIO, Peking, Kína). Az immunfestett metszeteket két mikroszkóppal fénymikroszkóppal megvizsgáltuk, és a festés intenzitása szerint félkvantitatívan értékeltük a 0 (nem festett) és 3 + (erős festés) skálán. A sejtek több mint 10% -ában 2+ vagy 3+ festéssel rendelkező szöveteket pozitívnak tekintettük a fehérje expresszió szempontjából. [16] A festett tárgylemezeket mikroszkóppal figyeltük meg és fényképeztük le (Olympus, Tokió, Japán).

statisztikai elemzések

A statisztikai elemzést a Statistics Product and Service Solutions szoftver (SPSS, 16.0 verzió, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) alkalmazásával végeztük. Az adatokat átlag ± standard hiba (SE) formájában jelentik. Két csoport közötti különbségeket Student t-próbájával vagy nem-paraméteres Mann-Whitney U-tesztjeivel értékeltük. Több csoportos összehasonlítást hajtottak végre egyirányú varianciaanalízissel (ANOVA), majd a legkevésbé szignifikáns különbségteszt alkalmazásával. Chi-négyzet tesztet alkalmaztunk az immunfestés gyakoriságának értékelésére csoportonként. Az összes P érték kétoldalas és P ESULTS volt

A magas zsírtartalmú étrend hatása a testsúlyra és a glükóz anyagcserére

Asztal 1

A testtömeg és a biokémiai paraméterek patkányokban a meghatározott étrend 40 hete után

GroupStD (n = 18) HFD (n = 18) tP

Testtömeg (g)

402,19 ± 13,49

542,14 ± 19,07

6.06

,†

75,57 ± 4,72 *, †

33.33

,‡

20.21

,‡

16.68

,†, ‡

59.02

,†, ‡

23.51

‡

4.20

0,013

A méh myometriumának vastagsága (µm)

383,86 ± 21,53

451,63 ± 25,83

360,86 ± 32,40

623,64 ± 48,26 *, †, ‡

12.53

† P ‡ P 2. táblázat]. Az összes állat számszerűsített és a 2. táblázatban bemutatott morfológiai eredményei a méhben szintén megmutatták az E2 hatását. A kontrollcsoportban az endometrium normál hámsejtjeit kuboid alakú luminális és mirigyes hámsejtekkel jellemeztük, a sejtek közepén a sejtmag orientálódott [1a. Ábra]. Az OVX-nek kitett HFD csoportban, amely nem E2 volt, kicsi a méh szarva, az uminalis és a mirigyes epitheliák atrófiák voltak, ami egyszerű alacsony oszlopos sejteket és alacsony citoplazma/mag arányt mutatott [1c. Ábra]. Ezzel szemben az E2 és HFD-E2 csoportokban kialakult hiperplasztikus méhnyálkahártyát megnagyobbodott méhszarvak és magasabb vagy pszeudostratizált oszlopos luminalis és mirigyes hámsejtek, valamint a citoplazma és a mag aránya jellemezte [ábra [1b ábra 1b és andd]. 1d]. A HFD-E2 csoportban a méh luminalis és mirigyes epitheliájának vastagsága és a myometrium szignifikánsan magasabb, mint az E2 csoporté [F = 59,02, F = 23,51 és F = 12,53, P 2. táblázat]. A laphám intraepithelialis metapláziát mind a luminalis, mind a mirigyes epitheliában kimutatták, és a HFD-E2 csoportban a squamous epithelialis metaplázia százalékos aránya 66,7% volt, szemben az E2 csoport 33,3% -ával.

Reprezentatív mikroszkópos képek a méh szöveteiben festett Hematoxylin és Eeosin festésről (eredeti nagyítás, × 400). A fekete nyilak a magas oszlop endometriumára mutatnak. a) kontrollcsoport, standard étrend + ál-petefészek-eltávolított + vivőanyag; (b) E2 csoport, standard étrend + ovariectomizált + 17β-ösztradiol; c) HFD csoport, magas zsírtartalmú étrend + ovariektomizált + vivőanyag; (d) HFD-E2 csoport, magas zsírtartalmú étrend + ovariectomizált + 17β-ösztradiol.

Plazma-adiponektin

A keringésben lévő adiponektin vizsgálatához a plazma adiponektin szintjét a 2. ábra mutatja. A kontroll csoporthoz képest a plazma adiponektin szintje szignifikánsan magasabb volt a HFD patkányokban (kontroll csoport: 6,28 ± 0,79 μg/ml vs. HFD csoport: 9,23 ± 0,72 μg/ml, F = 13,15, P 0,05). Az adiponectin receptorok mRNS szintje kimutatható volt a méh szövetében, de az ADIPOR1 és ADIPOR2 mRNS szintekben nem volt szignifikáns különbség az összes csoport között [3. ábra].

Az adiponektin (a), az adiponektin-receptor 1 (b) és a 2-es adiponektin-receptor (c) relatív mRNS-szintje a patkány méhében. Az eredmények az átlag ± standard hibát jelentik. * P 4. ábra]. Az adiponektin fehérje expressziója mind az E2, mind a HFD-E2 csoportban magasabb volt a kontroll csoporthoz képest [P = 0,131, kontroll csoport vs. E2 vagy HFD-E2 csoport; 3. táblázat]. A HFD csoporthoz képest az adiponektin fehérje expressziója szignifikánsan magasabb volt a HFD-E2 csoportban [88,9% vs. 11,1%, P = 0,003; 3. táblázat]. Nem volt azonban szignifikáns különbség mind az AdipoR1, mind az AdipoR2 expressziójában a négy csoport között.

Adiponektin, AdipoR1 és AdipoR2 expressziójának immunhisztokémiai elemzése patkány endometriumban (eredeti nagyítás, × 400). A fekete nyilak az endometrium adiponektin fehérje pozitív festésére utalnak. n = 9 minden csoportban. Kontroll: Normál étrend + ál-petefészek-eltávolítás + hordozó; E2: Normál étrend + ovariectomizált + 17β-ösztradiol; HFD: magas zsírtartalmú étrend + ovariectomizált + vivőanyag; HFD-E2: magas zsírtartalmú étrend + ovariectomizált + 17β-ösztradiol; AdipoR: Adiponectin receptor.

3. táblázat

Az adiponektin és az AdipoR fehérje expressziójának immunhisztokémiai elemzése endometriumban (n = 9)

TételekControlE2HFDHFD-E2

Adiponektin	4 (44,4)	8. (88.9)	1. (11.1)	8 (88,9) *
AdipoR1	2 (22.2)	4 (44,4)	7 (77,8)	4 (44,4)
AdipoR2	5 (55,6)	4 (44,4)	7 (77,8)	3. (33.3)

Az értékeket n (%) -ként tüntettük fel. A festés intenzitását a következőképpen értékeltük: 0, Negatív; 1, Gyenge; 2, Mérsékelt; 3, erős. A ≥2 pontszámmal rendelkező minták pozitívak. * P = 0,003, szemben a HFD csoporttal. Kontroll: Normál étrend + ál-petefészek-eltávolítás + hordozó; E2: Normál étrend + ovariectomizált + 17β-ösztradiol; HFD: magas zsírtartalmú étrend + ovariectomizált + vivőanyag; HFD-E2: magas zsírtartalmú étrend + ovariectomizált + 17β-ösztradiol; AdipoR: Adiponectin receptor.

D KÖZLEMÉNY

Itt egy olyan patkánymodellt hajtottunk végre, amelyben a patkányokat HFD-re helyeztük, hogy IR-t indukáljanak, és ösztradiollal adva az EH-t. Megvizsgáltuk mind a HFD, mind a 17β-ösztradiol hatását a plazma adiponectin koncentrációjára és a méh adiponectin rendszerére.

A jelen tanulmánynak számos korlátja volt. Először is, a patkányok száma nem volt elegendő ahhoz, hogy kimutassa a keringésben lévő lipidprofil és a méh adiponektin receptorainak különbségét, ezért nagyobb mintanagysággal további vizsgálatokra van szükség. Másodszor, más csoportoknak kell lenniük, köztük StD-vel etetett OVX patkányoknak és HFD-vel táplált ál-OVX patkányoknak, hogy megerősítsék a metabolikus rendellenesség és az ösztrogén hatását az endometrium elváltozására.

Összefoglalva, a HFD által indukált IR és 17β-ösztradiol által indukált EH patkánymodelljében tett megállapítások azt mutatták, hogy az IR vagy a hiperinsulinémia állapota modulálja a méh váltakozását. A plazma adiponektin szintjét mind az anyagcsere állapota, mind a szteroid hormonok, például az ösztradiol szabályozták. A méh adiponektin fehérjét azonban főleg az ösztradiol befolyásolta, amely különbözik az anyagcsere-rendellenességekkel kapcsolatos rendellenességektől, beleértve az IR-t is. Ennek ellenére további vizsgálatokra van szükség annak kiderítéséhez, hogy az adiponektin a méh szintjén hat-e a jelátviteli utak, például az AMP-aktivált protein-kináz szabályozására.

Pénzügyi támogatás és szponzorálás

Ezt a munkát a Kínai Nemzeti Természettudományi Alapítvány (81272870 sz.) Támogatásával támogatták.