A linagliptinnel végzett dipeptidil-peptidáz-4 gátlás megakadályozza a nyugati étrend okozta vaszkuláris rendellenességeket nőstény egerekben

Absztrakt

Háttér

Az érmegmerevedés, a szív- és érrendszeri betegségek kockázati tényezője felgyorsul, különösen az elhízásban és a 2-es típusú cukorbetegségben szenvedő nőknél. A preklinikai bizonyítékok arra utalnak, hogy a dipeptidil-peptidáz-4 (DPP-4) inhibitorok kardiovaszkuláris előnyökkel járhatnak, függetlenül a glikémiás csökkentő hatásoktól. A legújabb tanulmányok azt mutatják, hogy a magas zsírtartalmú és egyszerű cukortartalmú nyugati étrend (WD) fogyasztása a nőstény C57BL/6J egerekben aorta merevedést idéz elő a vérnyomás emelkedése előtt. A vizsgálat célja annak meghatározása volt, hogy a DPP-4 inhibitor, a linagliptin (LGT) beadása megakadályozza-e a WD által kiváltott aorta- és endotheliális merevség kialakulását nőstény egerekben.

Mód

A C56Bl6/J nőstény egereket 4 hónapig WD-vel etettük. Az aorta merevséget és az ex vivo endoteliális merevséget Doppler impulzus hullám sebességével (PWV), illetve atomi erő mikroszkóppal (AFM) értékeltük. Emellett megvizsgáltuk az aorta vazomotoros válaszait és a markerek átalakulását immunhisztokémiai úton. Az eredményeket kétutas ANOVA segítségével elemeztük, p

Háttér

Mód

Állatmodellek

Testsúly

A 4 hónapos kísérlet során megnövekedett súly értékeléséhez az egereket közvetlenül a kísérlet megkezdése előtt, 4 hetes korban és leölés előtt lemértük.

DPP-4 aktivitás vizsgálata

A DPP-4 aktivitás vizsgálatot a korábban leírt módon hajtottuk végre [15]. Röviden: a vért a leöléskor EDTA-csövekbe gyűjtöttük, és a plazmát -80 ° C-on tároltuk. 20 μl plazmát hígítottunk DPP-4 vizsgálati pufferben, és szubsztrátot, 200 M H-Ala-Pro-AFC-t (I-1680; Bachem) adtunk hozzá. A fluoreszcenciát Synergy mikrolemez-olvasóval mértük 405 nm gerjesztési hullámhosszon és 535 nm emissziós hullámhosszon [15].

Az aorta merevsége in vivo impulzus hullámsebesség (PWV) alapján

Doppler ultrahangot (Indus Mouse Doppler System, Webster, TX) izoflurán altatásban, egy korábban kialakított protokoll [9] szerint végeztünk az artériás merevség in vivo meghatározására szolgáló PWV értékelésére. A PWV-t az életkor, a vérnyomás és a pulzus befolyásolja. Következésképpen a PWV értéke m/s (kiigazítatlan), valamint pulzusra normalizált (HR). A WD etetési periódus 4 hónapra történő korlátozása lehetővé tette számunkra, hogy elkerüljük a megnövekedett vérnyomásnak az érmerevedésre gyakorolt hatásait, mivel a WD 4 hónapja nem indukálja a vérnyomás emelkedését a nőstény C57BL/6J egerekben [9].

Ex vivo vazomotoros válaszok az aortában

Az aorta vazomotoros válaszait a korábban leírtak szerint vizsgáltuk [9]. Röviden, az ereket U46619-gyel (100 nM) előzetesen szűkítettük, és kumulatív adagolással értékeltük az acetilkolinra (ACh) (1 nm - 100 μmM) és az inzulinra (INS: Novolin R, Novo Nordisk; 0,1–300 ng/ml) adott válaszokat. agonistát egy izolált edényfürdőhöz, a korábban leírtak szerint [9]. Minden kísérlet végén a PSS fürdőoldatot Ca 2+ mentes PSS-re cseréltük a maximális relaxáció meghatározása céljából.

Atomerő mikroszkópia (AFM) az erő méréséhez és a merevség kiszámításához

AFM-et alkalmaztunk az EC-k merevségének értékelésére a mellkasi aorta felszíni aorta-készítményeiben, a korábban leírtak szerint [9]. Az EC felület merevségét (rugalmassági modulusát) AFM-mel mértük nano-behúzási protokoll alkalmazásával [9].

Az aorta átalakítása és a fehérje mennyiségi meghatározása

A mellkasi aorta egy szegmensét 3% paraformaldehidben rögzítettük, dehidratáltuk, paraffinba ágyazottuk, és keresztben metszettük 5 um-os szeletekbe. A peri-aorta fibrózis értékeléséhez, a korábban leírtak szerint, a metszeteket picro sirius vörös színnel festettük. A mediális vastagság értékeléséhez a metszeteket Verhoeff-von Giesonnal festettük [9]. A rózsaszín színintenzitásokat és területeket „átlagos szürkeárnyalat-intenzitásként” számoltuk egérenként öt képen a MetaVue szoftverrel. Az aorta oxidatív stresszt az endotheliumban, a táptalajban és az aorta adventitia barna színének mennyiségi meghatározásával értékeltük, amely a 3-nitrotirozin képződését jelzi (1: 150 hígítás; Millipore, Billerica, MA), a korábban leírtak szerint [16]. A fibroblaszt-23 növekedési faktor (FGF-23) (1:50 hígítás; Novus NBP1-55830), klotho (1: 100 hígítás; Novus NBP1-76511) és előrehaladott glikációs végtermékek (AGE) expressziós szintje (1: 100 hígítás; Abcam ab23722) úgy határoztuk meg, hogy az aorta különböző komponensein a fluoreszcens képeken a jel intenzitását „átlagos szürke skála intenzitásként” számszerűsítettük.

Transzmissziós elektronmikroszkópia (TEM)

A TEM-et a korábban leírt módon, a JEOL 1400-EX TEM alkalmazásával végeztük a megnövekedett érmerevséghez kapcsolódó ultrastrukturális változások meghatározásához [17]. Röviden, az aorta mintákat összegyűjtöttük és 2% glutáraldehid/2% paraformaldehid oldatban rögzítettük, majd 1% osmium-tetroxiddal szekunder rögzítést végeztünk, Epon-Spurr gyantájába ágyazva, 85 nm-en metszettük és uranil-acetát/Sato hármas ólomfoltokkal festettük.

Statisztikai analízis

Az eredményeket átlag ± SE értékként jelentjük. A statisztikai elemzést elsősorban kétirányú ANOVA-val, majd post hoc t tesztekkel (Bonferroni) követték, hogy megvizsgálják a CD-vel vagy WD-vel etetett és az LGT-t egér-chow-ban vagy LGT-t nem tartalmazó egerek kimeneteleinek különbségeit (Sigma Plot 13.0, Systat Software) . Az aorta dilatátor válaszait a maximális relaxáció százalékában adjuk meg, [(Fb-Fd)/(Fb-Fmin)] * 100 számítással, ahol az Fd erő egy gyógyszeres beavatkozás után, Fb az alaperő és az Fmin a passzív folyamat során elért minimális erő körülmények.

Eredmények

Testtömeg, plazma DPP-4 aktivitás és AGE

A 20 hetes WDC és WDL egerek testtömegei hasonló súlyúak és nagyobbak voltak, mint a megfelelő sovány társaiké (1. kiegészítő fájl: S1 táblázat; 1a. Ábra). A testtömeg-növekedés százalékos aránya a 4 hónapos vizsgálati periódus alatt 71 ± 4 és 93 ± 6% volt CDC és WDC esetében (p> 0,05), illetve 74 ± 7% és 88 ± 7% CDL és WDL esetében (p> 0,05) ill. Így a DPP-4 gátlásnak nincs szignifikáns hatása a testtömegre (1. kiegészítő fájl: S1 táblázat; 1a. Ábra) az egyes táplálkozási rendszerekben a tesztidőszak alatt. Ahogy az várható volt, a DPP-4 plazmaaktivitása szignifikánsan csökkent mindkét csoportban, akiket diétás hatás nélkül kezeltek LGT-vel (1b. Ábra). Mivel az inzulinrezisztencia egyes modelljeiben az AGE-t összefüggésbe hozták az érmerevséggel [18, 19], megvizsgáltuk az AGE jelenlétét az aorta falán (1c. Ábra). A WD jelentősen megnövelte az AGE felhalmozódását az érfalban, és ezt az LGT beadása nem befolyásolta.

A DPP-4 gátlás megakadályozta a WD által kiváltott aorta- és EC-merevséget

In vivo

Négy hónap múlva CD-n vagy WD-n határoztuk meg a PWV-t egerekben (2a. Ábra). A PWV nem változott szignifikánsan a CDC egerekben (2a. Ábra; 1. táblázat). A PWV megemelkedett a WDC csoportban a CDC-hez képest (p. 2. ábra

Ex vivo

Nemrégiben beszámoltunk az ECM-t alkalmazó aorta-explantánsok megnövekedett EC-merevségéről 4 hónapos WD után nőstény egerekben [9]. Hasonlóképpen, ebben a vizsgálatban megnövekedett felületi merevséget figyeltünk meg az EC-ben WD-vel táplált egereknél (p 0,05 CDC-vel szemben WDL-vel) (2b. Ábra).

A DPP-4 gátlás javítja az aortában az endothelfüggő válaszokat

Nemrégiben beszámoltunk arról, hogy a nőstény C57BL/6J egerekben 4 hónapos WD-etetés károsodott protein-kináz B (Akt)/endotheliális nitrogén-oxid-szintáz (eNOS) jelátvitelt indukált, és ez az aorta endothelium-függő vazodilatációjának károsodásával járt [9]. Itt értékeljük az Akt/eNOS szignalizációt az aorta gyűrűkben funkcionális vizsgálattal, hogy megvizsgáljuk az ACh-ra és az inzulinra adott értágító válaszokat. A WD négy hónapos táplálása károsodott aorta endothelium-függő értágító válaszokat eredményezett az ACh-ra és az inzulinra a WDC-ben a CDC-vel összehasonlítva (3a. Ábra, b). Ezeket a hibákat megakadályoztuk a WDL csoportban (3a., B. Ábra).

A DPP-4 gátlás megakadályozza az érrendszer átalakulását

Korábban kimutattuk, hogy a WD táplálás fokozott aorta-átalakulást eredményez. Hasonlóképpen, a jelen vizsgálatban az aorta mediális vastagsága és a fibrózis szignifikánsan megnőtt a WD táplálásával a CDC-vel összehasonlítva (4a – d. Ábra). Fontos, hogy az aorta fibrózist és a megnövekedett mediális vastagságot megakadályoztuk a DPP-4 gátlásával (4a – d. Ábra).

A DPP-4 gátlás megakadályozza a WD által kiváltott ultrastruktúra változásainak növekedését az EC-ben

Az EC kontraktilis készülékének fokozott aktiválása összefüggésbe hozható az érmerevség genezisével [20]. Ebben a tanulmányban az aorta ultrastrukturális jellemzőit vizsgáltuk a különböző kísérleti csoportokban (5a – d. Ábra). A WD a luminalis endotheliális citoplazmatikus megnyúlás és a magkontrakció elvesztésével járt, és ezeket a rendellenességeket a WDL csoportban megakadályozták (5c. Ábra, d).

Az LGT kezelés enyhíti a WD által kiváltott luminalis EC citoplazmatikus megnyúlás és magkontrakció csökkenését. a, b CDC és CDL kohorszokat ábrázolnak normális EK jellemzőkkel; c ábrázolja az összehúzódott citoplazmát és az EC magjait a WDC-ben; d bemutatja a luminalis EC duzzanat, ödéma és összehúzódott citoplazma és magok hiányát c. Nagyítás × 800; rúd 2 µm. EL rugalmas lemez, IEL belső rugalmas lemez, N a luminalis endothel sejt sejtje, VSMC vaszkuláris simaizom sejt

A DPP-4 gátlás megakadályozza az oxidatív stresszt

Korábban kimutattuk, hogy a nőstényekben a WD-vel táplált vaszkuláris merevség fokozott vaszkuláris oxidatív stresszel volt összefüggésben [9]. Itt megmutattuk, hogy a WD fokozta az aorta oxidatív stresszt a 3-nitrotirozin immunfesték jelenlétével értékelve (6. ábra). Fontos, hogy a DPP-4 gátlás enyhítette az aorta oxidatív stresszt azáltal, hogy normalizálta a 3-nitrotirozint WD táplálással (6. ábra).

A DPP-4 gátlás megakadályozza a WD által kiváltott változásokat az FGF-23 és Klotho expresszióban az érfalban

Az FGF-23 artériás merevséggel és a CVD fokozott kockázatával társul [21–23]. Nemrégiben kimutattuk, hogy ez a WD táplálási paradigma megnövekedett FGF23 értéket eredményez az érfalban [24]. Ezenkívül a csökkent Klotho expresszió, amely egy másik, az érrendszer meszesedésében szerepet játszó fehérje, súlyosbítja az étrend által kiváltott érmerevséget [9]. Itt megvizsgáltuk, hogy a WD indukál-e változásokat az FGF-23 és Klotho expressziójában az aortában, és ha igen, akkor a DPP-4 gátlás megakadályozta-e ezt a változást (7. ábra). A várakozásoknak megfelelően az FGF-23 szignifikáns növekedését figyeltük meg a WDC csoport aorta endotheliumában és adventitiájában a CDC-hez képest, és ezt a növekedést a WDL csoportban megakadályoztuk (7a – c. Ábra). Ezenkívül a Klotho expressziót jelentősen csökkentette a WD táplálás és a DPP-4 gátlás megakadályozta ezt a hiányt az érfalban (7d – g. Ábra).

Vita

E vizsgálat eredményei együttesen alátámasztják azt a hipotézist, hogy a DPP-4 aktiváció fontos szerepet játszik az aorta merevség kialakulásában nőstény egerekben a WD által kiváltott inzulinrezisztencia hátterében. Ezenkívül bemutatjuk, hogy a DPP-4 gátlás megakadályozta a C57BL/6 J nőstény nőstényeket a WD által kiváltott aorta merevség, átalakulás és diszfunkció kialakulásában. Korábban beszámoltunk arról, hogy a 4 hónapos WD táplálás nem növeli a vérnyomást a C57BL/6J nőstényekben [9]. Ez az előző eredmény lehetővé tette számunkra, hogy megtervezzünk egy olyan kísérletet, amely potenciális vérnyomáshatást fejtett ki a DPP-4 gátlás CV védőhatásainak magyarázatára.

A DPP-4 gátlás jótékony érrendszeri hatásait mind a DPP-4 gátlás közvetlen hatásainak, mind a glukagon-szerű peptid-1 (GLP-1) rendelkezésre állásának járulékos növekedésének tulajdonítják [10]. Az edényben a DPP-4 mind az EC, mind a vaszkuláris simaizom sejtek (VSMC) citoplazmatikus membránjában helyezkedik el. Az EC-ben a DPP-4 expresszió fokozódik a cukorbetegség modelljeiben [25], a VSMC-ben pedig a DPP-4 expressziója előnyösen megnövekszik az érrendszeri átalakítás körülményeiben [11]. Fontos, hogy a vizsgálatunk során alkalmazott LGT dózis jelentősen gátolja a DPP-4 aktivitását [12, 14, 26].

Csoportunk korábban azt mutatta, hogy a nőstény egerek 4 hónapos WD-etetése az invazív módon mért aorta-merevség, valamint az ex vivo mért EC-merevség növekedését eredményezte [9]. Ennek a vizsgálatnak az egerek külön kohorszát használó eredményei közel azonosak voltak korábbi jelentésünkkel, és további aorta- és EC-merevséget mutatnak 4 hónapos WD-etetés után. Nevezetesen a DPP-4 gátlása megakadályozta a kezeletlen WD-vel táplált egerekben megfigyelhető aorta merevség kialakulását, mind in vivo, mind ex vivo. Bár korábbi jelentések azt mutatják, hogy a DPP-4 inhibitorok csökkentik a szívmerevséget [12, 27, 28], legjobb tudásunk szerint ez az első jelentés, amely a túlzott táplálkozás klinikailag releváns, nem diabéteszes női modelljében bizonyítja az érmegmerevedés elleni védelmet.

Hasonlóképpen, más egérmodellekben dokumentálták a DPP-4 gátlás jótékony szerepét az endothelfüggő értágulat helyreállításában fokozott oxidatív stressz esetén [33, 34]. Meg kell jegyezni, hogy annak ellenére, hogy az aorta értágító válaszainak nagysága ebben a vizsgálatban alacsonynak tűnik, hasonló eredményeket mutattak be más laboratóriumok egereknél is [35–37]. Ezenkívül ultrakonstruktív eredményeink azt sugallják, hogy a DPP-4 gátlás megfordítja a luminalis endotheliális citoplazmatikus megnyúlások és a WD táplálásával összefüggő magkontrakció veszteségét. Ezenkívül eredményeink azt mutatják, hogy a DPP-4 gátlás jótékony hatása nem korlátozódik az endotheliumra. Megfigyeltük, hogy a DPP-4 gátlás csökkenti a mediális vastagodást és a WD-táplálással kapcsolatos fibrózist. Az érelmeszesedés és a neo-intima sérülés modelljeiben korábban beszámoltak a DPP-4 inhibitorok vaszkuláris anti-fibrotikus szerepéről [34, 38].

Összefoglalva, a jelenlegi vizsgálat azt mutatja, hogy a DPP-4 gátlás megakadályozza a vaszkuláris merevség, az aorta fibrózis, az oxidatív stressz és az FGF-23/Klotho expresszió abnormális növekedését, amelyet WD indukál nőstény egerekben, és ezek az előnyök az AGE csökkenésétől függetlenül jelentkeznek. Eredményeink klinikai jelentőséggel bírnak, mivel az elhízott diabéteszes nőket gyakrabban érinti a megnövekedett érmerevség, amely valószínűleg magasabb CVD-t idéz elő férfi társaikhoz képest. Végül csak a jól megtervezett klinikai vizsgálatok eredményei tisztázzák az LGT szerepét a diabéteszes CVD kezelésében.