A fogyás plusz edzésprogram hatásainak feltáró elemzése az idősebb, túlsúlyos nők sejtminőség-ellenőrzési mechanizmusaira

Stephanie E. Wohlgemuth

1 Öregedési és Geriatológiai Tanszék, Öregedési Intézet, Orvostudományi Főiskola, Floridai Egyetem, Gainesville, Florida.

Hazel A. Lees

1 Öregedési és Geriatológiai Tanszék, Öregedési Intézet, Orvostudományi Főiskola, Floridai Egyetem, Gainesville, Florida.

Emanuele Marzetti

1 Öregedési és Geriatológiai Tanszék, Öregedési Intézet, Orvostudományi Főiskola, Floridai Egyetem, Gainesville, Florida.

2 Ortopédiai és Traumatológiai Tanszék, Szent Szív Katolikus Egyetem, Róma, Olaszország.

Todd M. Manini

1 Öregedési és Geriatológiai Tanszék, Öregedési Intézet, Orvostudományi Főiskola, Floridai Egyetem, Gainesville, Florida.

Juan M. Aranda

3 Orvosi Osztály, Orvostudományi Főiskola, Florida Egyetem, Gainesville, Florida.

Michael J. Daniels

4 Statisztikai Tanszék, Liberális Művészetek és Tudományok Főiskolája, Floridai Egyetem, Gainesville, Florida.

Marco Pahor

1 Öregedési és Geriatológiai Tanszék, Öregedési Intézet, Orvostudományi Főiskola, Floridai Egyetem, Gainesville, Florida.

Michael G. Perri

5 Klinikai és egészségpszichológiai tanszék, Közegészségügyi és Egészségügyi Szakmai Főiskola, Florida Egyetem, Gainesville, Florida.

Christian Leeuwenburgh

1 Öregedési és Geriatológiai Tanszék, Öregedési Intézet, Orvostudományi Főiskola, Floridai Egyetem, Gainesville, Florida.

Stephen D. Anton

1 Öregedési és Geriatológiai Tanszék, Öregedési Intézet, Orvostudományi Főiskola, Floridai Egyetem, Gainesville, Florida.

5 Klinikai és egészségpszichológiai tanszék, Közegészségügyi és Egészségügyi Szakmai Főiskola, Florida Egyetem, Gainesville, Florida.

Absztrakt

Bevezetés

Az életmódon alapuló beavatkozások csökkenthetik az izmok veszteségét és javíthatják a testösszetételt elhízott, idősebb felnőtteknél, de az optimális módszert még nem sikerült kialakítani. A kalóriakorlátozásra (vagyis 500-1000 kcal/nap kalóriadeficitre az egyensúlyi állapot alatt) általában szükség van a jelentős súlyvesztés eléréséhez. Az étrend okozta súlycsökkenés azonban általában a zsírmentes tömeg csökkenéséhez vezet, ami az idősebb felnőttek számára jelentős aggodalomra ad okot. Ezzel szemben a testmozgás növelheti az izomtömeget, javíthatja az izom minőségét, 11,12 és növelheti az izomfehérje szintézisét13, de ritkán okoz jelentős súlyvesztést, hacsak az egyének nagyon nagy mennyiségű mérsékelt vagy erőteljes tevékenységet nem folytatnak. 14 Ezért a túlsúlyos idősekkel dolgozó orvosok és kutatók számára az a kihívás, hogy olyan életmódon alapuló beavatkozásokat tervezzenek, amelyek jelentős fogyást eredményezhetnek, miközben elkerülik (vagy korlátozzák) a zsírmentes tömeg csökkenését. 15

Az egészséges mitokondriumok általi energiatermelés ugyanolyan fontos, mint a sejtszintű minőségellenőrzési folyamatok a sejtműködés fenntartása érdekében. A mitokondriális funkció azonban az életkor előrehaladtával csökken és a diszfunkcionális mitokondriumok felhalmozódnak, ami további sejtkárosodást okoz (áttekintést lásd a 26. és 27. hivatkozásban). Ezért a mitokondriális biogenezissel kiegyensúlyozott sérült mitokondriumok autofág eltávolítása és lebontása elengedhetetlen a sejttel kapcsolatos életkorral összefüggő csökkenés megelőzéséhez vagy csillapításához. Fiatalabb felnőtteknél a testmozgás és a kalória-korlátozás serkenti a vázizom mitokondriális biogenezisét. 11,12 Ezenkívül a mitokondriumokonkénti kriszták száma, valamint a mitokondriális elektrontranszportlánc összetevői nőnek. 14 Azt azonban még meg kell határozni, hogy ugyanazok a hatások figyelhetők-e meg idősebb felnőtteknél egy testmozgás és diéta közben. Ha hasonló biológiai változások fordulnak elő idősebb felnőtteknél, akkor a mitokondriális funkció javulása lehet egy másik mechanizmus, amely révén a fogyás és a testmozgás javíthatja a fizikai funkciókat és csökkentheti a túlsúlyos idősek funkcionális csökkenését.

Ezért a jelen tanulmány célja az volt, hogy idősebb, túlsúlyos nők csontvázában értékelje a súlycsökkenés plusz testmozgás hatását az autofágia markereire, az UPS komponenseire, valamint a gyulladás, az apoptózis és a mitokondriális markerekre. biogenezis és működés. Feltételeztük, hogy az étrendi korlátozás és a testmozgás kombinációja stimulálja a sejtek minőség-szabályozási folyamatait (konkrétan az autofágia és az ubiquitin proteaszóma út komponensei), csillapítja a gyulladást és az apoptózist, valamint javítja a mitokondriális funkciót. Feltételeztük azt is, hogy javulni fog a testsúlycsökkentésben és a testmozgásban részt vevő egyének fizikai teljesítőképessége.

Anyagok és metódusok

Résztvevők

A jelen feltáró tanulmányhoz összesen 13 résztvevőt vontak be, akik beleegyeztek abba, hogy perkután izombiopsziát végezzenek a beavatkozás előtt (előtte) és utána (után). Ezen résztvevők közül 7-et randomizáltak az oktatási kontrollcsoportba, 6-ot pedig a fogyás és testmozgás (WL + E) csoportba. Ne feledje, hogy az izombiopsziák nem hoztak elegendő mennyiségű szövetet ahhoz, hogy az összes elemzést elvégezhessék az összes résztvevővel. Az egyes elvégzett elemzésekbe bevont résztvevők számát a megfelelő grafikonok vagy táblázatok mutatják.

Tanulmányterv és beavatkozások

A nagyobb, randomizált, kontrollált vizsgálat, amelyből ennek a feltáró vizsgálatnak az alcsoportját levonták, egyetlen vak vizsgálatot tartalmazott, amelyben a tesztelésért felelős személyzet elvakult a résztvevő kijelölt beavatkozási csoportjával szemben. A jogosult résztvevőket randomizálták vagy a WL + E beavatkozásba, vagy egy oktatási kontroll csoportba. A számítógépes randomizáláshoz a SAS PROC PLAN-ját használták. 29.

A WL + E beavatkozás 6% -os vagy annál nagyobb súlycsökkenést célzott az energiafogyasztás mérsékelt csökkentésével (azaz 500–1000 kcal/nap csökkenéssel) párosulva olyan testmozgásokkal, amelyek során a résztvevők mindkét aerob tevékenységet (azaz séta) és alsó test közepes intenzitású ellenállóképzés. A résztvevők heti, csoportos súlykontroll-foglalkozáson vettek részt regisztrált dietetikus és magatartástudományi képzéssel rendelkező doktorandusz vezetésével. Minden résztvevő kalória-hozzárendelése ∼750 kcal/nap hiányt jelentett a kiindulási becsült energiafogyasztáshoz képest, amelyet az élelmiszerrekordok elemzésével határoztak meg. Az ilyen kalóriakorlátozás célja a súlycsökkenés elősegítése volt, 1,5 font (0,7 kg)/hét sebességgel. Az American Heart Association táplálkozási ajánlásaival összhangban 30 az étrend szénhidrátokból, zsírokból és fehérjékből származó energiabevitel 55% -át, 30% -át és 15% -át tartalmazta. Az ételeket saját maguk választották ki regisztrált dietetikus felügyelete alatt. A résztvevőket arra utasították, hogy töltsék ki a napi étkezési nyilvántartásokat, amelyeket minden csoportos foglalkozásra hoztak. Ezen csoportos foglalkozások során az egyes résztvevők étkezési rekordjait a regisztrált dietetikus átnézte, és konkrét javaslatokat adott az étrend megváltoztatásáról, hogy segítsen a résztvevőknek elérni a kalóriatartalmat.

A gyakorlati beavatkozás aerob, erősítő edzésből és rugalmassági gyakorlatokból állt. A gyaloglás volt az elsődleges ösztönzött aerob tevékenység, de más tevékenységi formákat (pl. Álló kerékpározás) is alkalmaztak, ha a résztvevők sérülés miatt nem tudtak járni. A harmadik hét után a résztvevőket arra bíztatták, hogy teljesítsék a heti 150 perc gyalogolási célt. A beavatkozás során minden héten három felügyelt testedzést tartottak. A vérnyomást és a pulzusszámot minden edzés előtt és után figyelték, amelyet rövid bemelegítés, majd lehűlési időszak követett. A résztvevők az egyes foglalkozások során két 15 perces sétát hajtottak végre. Az első gyalogló mérkőzést követően a résztvevőket egy ötperces erőnléti edzés során öt alsó testgyakorlat (azaz széles lábguggolás, álló lábgöndörítés, térdhosszabbítás, oldalsó csípőemelés és lábujj állás) teljesítésére végezték. Minden gyakorlatnál a résztvevőket arra bíztatták, hogy hajtsanak végre egy 10 ismétlésből álló szettet, pihenjenek 1 percig, majd végezzenek egy második szettet. Boka súlyokat alkalmaztunk az ellenállás növekvő szintjének biztosítására. A második gyaloglás után a résztvevők 5 perces lehűlési periódust folytattak, amely során egy sor rugalmas gyakorlatot végeztek.

A résztvevőket fokozatosan ismertették meg a beavatkozási gyakorlatokkal, kezdve a könnyebb intenzitású gyakorlással és fokozatosan növelve az intenzitás szintjét a beavatkozás első 2-3 hetében. A kezdeti alkalmazkodási fázist követően a résztvevőket arra utasították, hogy kezdjék el a Borg Perceived Exertion skála által meghatározott közepes intenzitású járást. 31 résztvevőt arra kértek, hogy 13-as intenzitással járjanak (az aktivitás észlelése „kissé nehéz”), és nem engedték meg nekik, hogy 15 („kemény”) vagy 11. („meglehetősen nehéz”) és annál alacsonyabb szinten gyakoroljanak. Az erő-edzés komponens esetében a résztvevőket arra bíztatták, hogy minden gyakorlatot 15–16 („kemény”) intenzitással végezzenek.

Az oktatási kontrollcsoport résztvevőit arra kérték, hogy tartsák fenn szokásos étkezési és fizikai aktivitási szokásaikat, és ne végezzenek semmilyen szándékos erőfeszítést 6 hónapon keresztül a fogyás érdekében. A beavatkozás során ennek a csoportnak a résztvevői havonta vettek részt egészségnevelési előadásokon az idősebb felnőttek számára releváns témákról, amelyek nem kapcsolódtak a fogyáshoz, az étrendhez vagy a fizikai aktivitáshoz (pl. Bőrvédelem, alváshigiéné). 6 hónapos értékelésüket követően e csoport résztvevőinek lehetőséget kínáltak a teljes, 24 hetes WL + E beavatkozáshoz.

Antropometriai és fizikai funkciók eredménymérői

A testtömeget éhgyomorra mértük, és miután a beavatkozás megkezdése előtt reggel, majd annak befejezését követően ismét kiürült. A fizikai funkciót úgy értékeltük, hogy meghatároztuk a 400 méter feletti járási sebességet. A résztvevőket arra kérték, hogy teljesítsenek egy szokásos gyalogos tanfolyamot a szokásos ütemben. A séta során a résztvevők megállhattak, de nem ülhettek és nem kaphattak segítséget másoktól, és 15 percen belül teljesíteniük kellett a tanfolyamot.

Izombiopszia

A biopsziákat a vastus lateralis izomból nyertük perkután, a beavatkozás előtt (előtte) és 6 hónap után (poszt után). Az izmok mintáit megtisztítottuk a vértől és a zsírtól, és azonnal átfagyasztottuk folyékony nitrogénben a biokémiai vizsgálatokhoz. Külön szövetdarabot merítettünk az RNAlater-be (Ambion, Austin, TX) és folyékony nitrogénben fagyasztottuk le a génexpressziós vizsgálatokhoz. Az egyes elemzések csoportonkénti résztvevőinek számát a grafikonok vagy táblázatok mutatják be. Ne feledje, hogy egyes résztvevők szöveti korlátai miatt nem tudtunk minden elemzést elvégezni az összes mintán.

Fehérje expresszió: Szubcelluláris frakcionálás és immunblottolás

Az izomminták szubcelluláris frakcionálását a korábban leírtak szerint hajtottuk végre. 32 citoszolos frakciókat használtunk a hasított kaszpáz 3 (Millipore, Temecula, CA) és az aktív kaszpáz 8 (Abcam, Cambridge, MA) kimutatására. Megmértük a citokróm c-oxidáz 4 alegységet (Cox4; Cell Signaling, Danvers, MA), az 1. citokróm c oxidáz alegységet (Cox1; Mitosciences, Eugene, OR) és A mitokondriális transzkripciós faktort (TFAm; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornia). a mitokondriális frakcióban, míg a G endonukleáz (EndoG; Abcam, Cambridge, MA) és az apoptózist kiváltó faktort (AIF; BD Biosciences, San Jose, Kalifornia) mind a mitokondriális, mind a nukleáris frakcióban meghatároztuk. Az elektroforézist és az immunblottot máshol részletesen elvégeztük. 32 digitális képet rögzítettünk egy Alpha Innotech Fluorchem SP képalkotóval (Alpha Innotech, San Leandro, Kalifornia), és az AlphaEase FC szoftver (Alpha Innotech) segítségével elemeztük őket. A célsávok spot sűrűségét (tetszőleges optikai sűrűség [OD] egységek) normalizáltuk az egyes sávokban betöltött fehérje teljes mennyiségére, amelyet a megfelelő Ponceau S-festett membránok densitometriai elemzésével határoztak meg. 33

Gén expresszió: Kvantitatív valós idejű PCR

A mitokondriális légzőkomplexek aktivitása és tartalma: Blue Native poliakrilamid gélelektroforézis

Mitokondriális extrakció

Körülbelül 40 mg izomot homogenizáltunk 1 ml extrakciós pufferben (20 mM 3- (N-morfolino) propánszulfonsav [MOPS], 440 mM szacharóz, 1 mM EDTA és 0,5 mM fenil-metil-szulfonil-fluorid [PMSF], pH 7,2 4-nél. ° C-on) és centrifugáljuk 500 x g-vel 10 percig. A felülúszót összegyűjtöttük, és 20 000 x g sebességgel 20 percig centrifugáltuk. A kapott pelletet 30 μl pufferben (1 M aminokapronsav, 50 mM Bis-Tris és 0,2 mM PMSF, pH 7,0 4 ° C-on) szuszpendáljuk, és a membránok szolubilizálását 30% n-dodecil-maltoziddal érjük el. A szuszpenziót jégen 30 percig inkubáltuk 5 percenként vortexeléssel, majd 30 percig 100 000 x g sebességgel centrifugáltuk (Beckmann Optima LE-80K ultracentrifuga, rotor 50,2 Ti, 28 300 rpm). A kapott felülúszót összegyűjtjük és -80 ° C-on tároljuk.

Natív elektroforézis

A mintákat 10 tömeg/térfogat% Coomassie Brilliant Blue G-250-vel aminokapronsavban (1 M) és glicerinben készítettük. Körülbelül 40 μg mintafehérjét és 15 μg kontrollfehérjét (szarvasmarha-szív mitokondrium, Mitosciences) töltöttünk 3–12% -os gradiensű előre elkészített gélekre (Invitrogen, Carlsbad, CA). A futó pufferek jéghideg katódpuffert (50 mM tricin, 15 mM Bis-Tris, pH 7,0 4 ° C-on) és anódpuffert (50 mM Bis-Tris, pH 7,0 4 ° C-on) tartalmaztak. Végül 10 ml katódpuffert, amely 0,5% Coomassie Brilliant Blue G-250-et tartalmaz, hozzáadjuk, és a gélkészülékben összekeverjük a katódpufferrel. Az elektroforézist 4 ° C-on az alábbiak szerint hajtottuk végre: 70 V 30 percig, majd 170 V körülbelül 1 órán át. A katódpuffert eltávolítottuk és Coomassie festés nélküli katódpufferrel helyettesítettük. A gélt ezután kb. 2 órán át 170 V-on futtattuk.

Gélen belüli aktivitásvizsgálat

Közvetlenül az elektroforézist követően gélen belüli enzimatikus kolorimetriás reakciókat hajtottak végre az I, II, IV és V komplexek esetében Zerbetto és mtsai. 35 aktivitás-puffer a következő volt: I komplex (nikotinamid-adenin-dinukleotid [NADH] dehidrogenáz), 2 mM Tris · HCl, 0,1 mg/ml NADH és 2,5 mg/ml NBT (nitrokék-tetrazólium), 1:10 (tömeg/térfogat) hígításban. ); II komplex (szukcinát-dehidrogenáz), 1,5 mM foszfátpuffer, amely 4,5 mM EDTA-t, 10 mM kálium-cianidot, 0,2 mM fenazin-metoszulfátot, 84 mM nátrium-szukcinátot, 10 mM nitroblue tetrazolium-kloridot tartalmaz; IV komplex (citokróm c-oxidáz, COX), 5 mg 3,3 diaminobenzidin 9 ml 50 mM foszfátpufferben oldva, 10 mg citokróm c, 0,05 ml kataláz (20 μg/ml) és 0,75 mg szacharóz; komplex V (adenozin-trifoszfát [ATP] szintáz), 35 mM Tris, 270 mM glicin, 14 mM MgS04, 0,2% Pb (NO3) 2 és 8 mM ATP. Az összes puffer pH-ja 7,4 volt. Az enzimatikus reakciókat addig hagytuk folytatni, amíg az optimális színt nem figyelték meg. A képeket Alpha Innotech Fluorchem SP képalkotóval (Alpha Innotech) rögzítettük, és a kvantálást az AlphaEase FC szoftver (Alpha Innotech) segítségével hajtottuk végre. A célsávok (tetszőleges OD egységek) spot sűrűségét komplex tartalomra normalizálták.

Összetett tartalom

Western-blot analízist végeztünk a komplex tartalom meghatározására. A mitokondriális kivonatokat a fent leírt módon elektroforézissel hajtottuk végre. Ezután a membránokat egy éjszakán át inkubáltuk az egyes komplexek elleni primer antitestekkel (1: 200) (mitosciences). A másodlagos antitest inkubálást, a kemolumineszcens jel előállítását, a digitális felvételt és a sávok sűrűségmérését a fent leírtak szerint hajtottuk végre. Az egyes sávokban betöltött fehérje teljes mennyiségét Ponceau S festéssel határoztuk meg, és terhelés kontrollként használtuk.