A drámai étrendi váltás fenntartja a megkötött toxinokat a kémiailag védett kígyókban

Szerkesztette: David B. Wake, Kaliforniai Egyetem, Berkeley, Kalifornia, és jóváhagyta 2020. január 22-én (2019. október 31-én kapott felülvizsgálatra)

Jelentőség

Az elkülönített toxinokkal védett állatoknak alternatív védekező vegyi anyagot kell használniuk, ha az étrendben változik. A Rhabdophis nemzetségbe tartozó kígyók olyan védekező mirigyekkel rendelkeznek, amelyek erőteljes védekező toxinokat tárolnak, amelyek bufadienolidokként ismertek. A Rhabdophis ősi zsákmánya anurán kétéltűekből áll, beleértve a varangyokat (Bufonidae), amelyek a megkötött bufadienolidok forrásai. A származtatott Rhabdophis-klád tagjai azonban nem toxikus földigilisztákat fogyasztanak elsődleges zsákmányukként, integumentális mirigyeik azonban még mindig bufadienolidokat tartalmaznak. Bemutatjuk, hogy a féregevő klád kígyói elsősorban a lárva szentjánosbogarak elfogyasztásával nyerik védekező toxinjaikat. Megállapításunk egy figyelemre méltó evolúciós példa, amelyben a gerincesről a gerinctelen zsákmányra való áttérés a megkötött védekező toxinok azonos kémiai osztályát biztosítja.

Absztrakt

A kémiailag megvédett állatok szintetizálhatják toxinjaikat a nem toxikus prekurzorokból, vagy külső forrásból beszerezhetik őket, és tárolhatják őket egy ragadozó elleni átcsoportosítás céljából. Az ilyen elkülönített védekezések elterjedtek a gerinctelenek között, de kevésbé ismertek a gerincesek körében (1). A japán natricine colubrid kígyó, a Rhabdophis tigrinus zsákmányként fogyasztott, varangyokból (Bufonidae) származó erős kardiotonikus szteroidokat (bufadienolidokat) ismer el (2 ⇓ –4). A varangyok szintetizálják a BD-ket koleszterinből az integumentalis mirigyükben (5), az R. tigrinus pedig a méreganyagokat magába szívja és a nyak háti bőrében elhelyezkedő nuchalis mirigyekként (NG) ismert szerkezetekben tárolja. Amikor a kígyót megtámadják, az NG-k elszakadnak, és felszabadítják a varangyokból elkülönített mérgező toxinokat. Számos más ázsiai kígyófaj rendelkezik NG-vel vagy hasonló szerkezetekkel, amelyek a test teljes hosszában meghosszabbodnak (nücho-dorzális mirigyek, NDG-k). Egy nemrégiben végzett kutatás megerősítette, hogy az NG-vel vagy NDG-vel rendelkező kígyófajok mindegyike a Natricinae monofiletikus vonalához tartozik, és mindegyik a Rhabdophis nemzetségbe tartozik (6). A filogenitás azt is feltárja, hogy a Rhabdophis alapfajai anurán kétéltűeket zsákmányolnak, amelyek tehát úgy tűnik, hogy e törzs ősi étrendjét tartalmazzák (1B. Ábra).

A bufadienolidok a kardiotonikus szteroidok egy csoportja, amelyet megkülönböztet egy hattagú laktongyűrű jelenléte a szteroidmag C-17 helyzetében (SI függelék, S1. És 2. ábra), ellentétben az öttagú gyűrűvel. jellemzi az ismertebb kardenolid vegyületeket, például a digoxint és az ouabaint. Mind a BD-k, mind a cardenolidok farmakológiai hatásukat az Na +/K + -ATPáz (NKA) gátlásával fejezik ki, amely mindenütt jelenlévő sejtfelszíni enzim szállítja a nátriumionokat a sejtekből és a káliumionokból. Az NKA gátlása növeli és meghosszabbítja a szívizom összehúzódását., ezek a vegyületek hatásos toxinokká teszik a gerinces ragadozók legtöbbjét. Az NKA rezisztens paralógjait kódoló mutációk azonban különböző állatcsoportokban (7 ⇓ –9), köztük a Rhabdophis-ban (10) alakultak ki, lehetővé téve számukra a kardiotonikus szteroidok fogyasztását és egyes esetekben tárolását.

Az R. pentasupralabialis mirigyfolyadékának teljes ionkromatogramja (TIC) és az 1-4 vegyületek szerkezete. A főbb vegyületek a bufadienolidok ultraibolya (UV) spektrális jellemzőit mutatták (lmax 295 nm, CH3OH/H2O-ban). „I.S.” = belső standard (digitoxigenin).

A varangyok mellett egyes szentjánosbogarakban (Lampyridae) előfordulnak BD-k, amelyekben kifejezetten lucibufaginekként említhetők (1A. Ábra) (11, 12). Egyes szentjánosbogárfajok (úgynevezett „femmes fatales”) nőstényei agresszív mimikával nyerik BD-jüket, csalogatják és fogyasztják a kémiailag védett fajok hímjeit, ezáltal szétválasztással szereznek toxinokat (13). Más szentjánosbogarak szintetizálhatják BD-jüket, de a szentjánosbogarak bioszintetikus útját nem sikerült azonosítani (14). A varangyok és a szentjánosbogarak az egyetlen olyan állatok, amelyekről jelenleg ismert vagy feltételezhető, hogy szintetizálják ezeket a vegyületeket.

Itt egy figyelemre méltó esetről számolunk be, amikor a Rhabdophis származtatott kládja elsődleges étrendjét kétéltűekről földigilisztákra helyezte át, és ezzel az étrendváltozással egyidejűleg a megkötött védekező toxinok forrását a varangyokról a szentjánosbogarakra helyezte át. Adataink azt mutatják, hogy az étrend evolúciós változása a gerinces és a gerinctelen zsákmány között egy új zsákmányforrásból ugyanezen elválasztott vegyületek megszerzésével járt, ezáltal megőrizve a ragadozó kémiai védelmét. Noha egyes fitofág rovarok és sok mérgebéka változatos étrendet és különféle növényekből vagy ízeltlábúakból származó vegyületeket fogyaszt (15, 16), az itt közölt drámai eltolódás egy gerincesből az azonos típusú védekező vegyületek ízeltlábú forrásába jelent rendkívüli evolúciós esemény.

Eredmények és vita

A Rhabdophis-on belül van egy származtatott klád, a R. nuchalis csoport, amely R. nuchalis-t, Rhabdophis pentasupralabialis-t és Rhabdophis leonardi-t tartalmaz. Ez a fajcsoport átesett a kétéltűek ősi étrendjéről a földigiliszták által uralt étrendre (1B ábra) (6). A R. nuchalis csoport tagjai kisebbek, mint a többi Rhabdophis, kevésbé drámai színűek és keskenyebb a fejük. Ez utóbbi jellemző viszonylag rövidebb kvadrátcsontokat (17) tükröz, ami jellemző a hosszúkás zsákmányokat, például földigilisztákat fogyasztó kígyókra. A R. nuchalis Group étrendjéről szóló korlátozott irodalom azt sugallja, hogy ezek a kígyók főként földigilisztákat és meztelen csigákat fogyasztanak (18). Megerősítettük, hogy a vad R. pentasupralabialis étrendje elsősorban földigilisztákból áll. 28 megőrzött minta béltartalmának vizsgálata során 12 ragadozó maradványt tártak fel, amelyek közül nyolc tartalmazott egy vagy két földigilisztát (SI függelék, S1. Táblázat). A 10 p. A bevihetően naiv keltetők standard kémiai preferenciájának vizsgálata hasonló tendenciát mutatott: erős kémiai preferencia a giliszták, a közepes a varangyok esetében, és a ranid békák esetében nem volt szignifikáns a preferencia (SI függelék, S2 ábra és S2 táblázat).

Elemeztük a R. pentasupralabialis nucho-dorsalis mirigyéből származó folyadékot, és megállapítottuk, hogy a folyadék BD-ket tartalmaz. A giliszták azonban nem ismertek BD-k termelésében; több taxont teszteltünk, és nem sikerült kimutatni a toxinokat. Így a földigiliszták nagyon valószínűtlen BD-k forrásai a kígyókban. Az R. pentasupralabialis NDG folyadékából négy bufadienolidot azonosítottunk és szerkezetileg jellemeztünk, amelyekről a Rhabdophis korábban nem számolt be (2. és 3. ábra). Az 1. (448) és a (4) (564) vegyületeket azonban korábban izolálták egy észak-amerikai szentjánosbogárból, a Lucidota atra-ból (19). A másik kettő, a 2. (490A) és a 3. (490B) vegyület új BD-k, mindkettőt megtaláltuk a tajvani szentjánosbogár Diaphanes lampyroides-ból is. Fontos, hogy a bufadienolid-xilozidokról, például az 564-es vegyületről korábban csak szentjánosbogarakból származó állatokról számoltak be (1A. Ábra) (12, 19), ami alátámasztja azt a hipotézist, miszerint az R. pentasupralabialis a szentjánosbogarak bufadienolidjait tárolja. Ezt a négy BD-t is kinyertük R. R. nuchalis és R. leonardi (3. ábra), a R. nuchalis csoport mindkét tagjának legalább egy példányából. Ezek a megállapítások azt mutatják, hogy a toxinforrásnak a varangyokról a szentjánosbogarakra történő elmozdulása a féregevő család származéka.

Az R. pentasupralabialis és/vagy R. tigrinus közül az NMR alapján azonosított hét bufadienolid, és megfigyelt százalékuk a R. nuchalis csoport három fajában (R. pentasupralabialis, R. nuchalis és R. leonardi). Az [M + H] + ionokat, a retenciós időt és az A-B gyűrű sztereokémiáját mutatjuk be az egyes vegyületekre. A megfigyelt frekvenciák NMR vagy HPLC elemzésen alapulnak. A tudományos nevek után zárójelben szereplő számok a minta nagysága. Az R. pentasupralabialis-ból azonosított bufadienolidokat kék rombusz veszi körül, a R. tigrinus-ból pedig vörös rombusz veszi körül.

A hipotézist, miszerint ezt a négy vegyületet szentjánosbogarakból választják el, a vegyületek sztereokémiája tovább támasztja alá. Az összes R. pentasupralabialis-ból azonosított bufadienolid rendelkezik transzfúziós A-B gyűrűrendszerrel. A szentjánosbogarak BD-je magában foglalja a transz- vagy cisz-kondenzált gyűrűkkel rendelkező vegyületeket, míg a varangyok összes BD-je (és a varangyokból R. tigrinus által elkülönítettek) cisz-kondenzált AB gyűrűs rendszerrel rendelkezik (1A ábra) (2, 20 ⇓ ⇓ –23). Az ugyanazt a sejtfelszíni fehérjét (NKA) megcélzó kardenolidokból ismert, hogy az A-B gyűrűkapcsolat mindkét típusa mérgező, de a cisz-csatlakozású vegyületek farmakológiai hatása valamivel erősebb, mint a transz-csomópontúaké (24). Jelentős az is, hogy a 2. és 3. vegyület a C-2, illetve a C-3 helyzetben acetilezett. Egyes szentjánosbogár-BD-kről ismert, hogy a C-2, C-3, C-4 vagy C-16-on acetilezettek, míg a varangy-toxinokról csak a C-16-on acetilezettek, ha egyáltalán (1A. Ábra) (25 ).

Kémiai vizsgálataink következtetéseit tovább támasztja alá az R. pentasupralabialis táplálkozási és viselkedési prédai preferenciáinak vizsgálata. A földigiliszták mellett a 12 megőrzött, béltartalmú kígyó közül ötből nyolc lámpás szentjánosbogár (Diaphanes sp.) Lárvát nyertünk ki a gyomorból és/vagy a belekből (SI függelék, S1. Táblázat). Külön laboratóriumi etetési vizsgálatokban az öt R. pentasupralabialis közül legalább három önként elfogyasztotta egy rokon lampirin szentjánosbogár (Pyrocoelia sp.) Lárváit. Kémiai, táplálkozási, táplálkozási és viselkedési vizsgálataink együttvéve azt mutatják, hogy az R. pentasupralabialis elsősorban földigilisztákkal táplálkozik, de emellett lampirin szentjánosbogár lárvákat is fogyaszt, és ezekből a rovarokból elkülöníti bufadienolidjait (1B ábra). A kémiai, táplálkozási és viselkedési vizsgálatok azt is sugallják, hogy a varangyok megmaradnak az étrend kisebb elemeként és a BD-k kisebb forrásaként.

A Rhabdophis fajok közül az elsődleges étrendben a békákról a földigilisztákra való váltás nem szokatlan. A földigiliszták bőségesek, elterjedtek és hosszúkás formájúak, így a korlátozott ásványosságú kígyók számára is elérhetővé teszik őket. Következésképpen sokféle kígyófaj fogyasztja őket, amelyek különböző nemzetségekhez tartoznak (34). Valójában néhány más natricinus nemzetség, például a Thamnophis (Észak-Amerika) és a Hebius (Ázsia) olyan fajokat tartalmaz, amelyek földigilisztákat fogyasztanak, gyakran a békák és egyéb zsákmányok mellett (35, 36). A földigilisztáktól eltérően azonban a rovarokat vagy más ízeltlábúakat viszonylag kevés alethinophidi kígyófaj fogyasztja el (17, 37). Ezért figyelemre méltó a toxikus zsákmány eltolódása a Rhabdophis-ban, a bufadienolidok (varangyok) ősi forrásától az azonos típusú toxinok (szentjánosbogarak) filogenetikailag távoli forrásáig (1B. Ábra).

Anyagok és metódusok

Fajok vizsgálata.

Az R. pentasupralabialis egy közepes méretű natricine kígyó, amelyet a kínai Szecsuán és a Yunnan tartományokban terjesztenek. Eredetileg R. nuchalis (40) egyik alfajaként írták le, majd Zhao (41) teljes fajgá emelte. Mori és mtsai. (42) kimutatta a nucho-dorzális mirigyek jelenlétét az R. pentasupralabialisban, ahogy Smith (43) is leírta R. nuchalis esetében. További kémiai adatok állnak rendelkezésre a R. nuchalis és a R. leonardi esetében, amelyek mindketten a R. nuchalis csoport tagjai, valamint a Rhabdophis formosanus, a Rhabdophis himalayanus, a Rhabdophis lateralis, a Rhabdophis plumbicolor, a Rhabdophis subminiatus, a Rhabdophis swinhonis és az R. tigrinus, amelyek mindegyikén nychal vagy nycho-dorzális mirigy található (lásd a SI függelék kiegészítő adatait a minták méretéhez és elhelyezkedéséhez).

Zsákmánypreferencia és etetési tesztek.

A szentjánosbogarak etetésének vizsgálatához öt felnőtt R. pentasupralabialis-t (orrnyílás hossza, 485–605 mm, két hím és három nőstény) használtunk Xingou-ban, Ya'an, Sichuan tartomány, Kína 2016 augusztusában. Minden kígyót tartottak műanyag ketrecben (kb. 40 × 60 × 40 cm) a Leshani Nemzeti Egyetem laboratóriumában, 25 ° C levegő hőmérsékleten, 70–80% páratartalom mellett és 14:10 d: éjszakai fényciklus (fény: 0600-2000 h). A tűzgyújtási kísérleteket augusztus végétől szeptember elejéig végezték, és a vizsgálatok előtt legalább 1 hétig nem kínáltak ételt. Bevezettünk három Pyrocoelia sp. Lárvát. (Jiangxi tartományban gyűjtötték) a ketrecbe és ~ 72 órán át hagyták őket. Infravörös világítással felszerelt videokamerát (HIKVISION, DS-7908N-E4) állítottak a ketrec fölé, hogy rögzítse a kígyót későbbi elemzéshez.

Kémiai reakciót végeztek 2014. szeptember 5-én, 19 befogadóan naiv keltetőt használva annak megállapítására, hogy az R. pentasupralabialis veleszületetten preferálja-e a gilisztákat és/vagy a varangyokat. A kémiai ingerek előkészítése és bemutatása egy jól bevált protokollt követett a kémiai diszkrimináció tesztelésére a vomeronasalis szerv által Squamatában (45, 46). A kígyóknak bemutatták a potenciális zsákmány felületi ingereit hordozó pamut törlőket. A kémiai ingerekre használt állatok közé tartoztak a békák (Fejervarya fujianensis, Ranidae); varangyok (B. gargarizans, Bufonidae); gyíkok (Gekko subpalmatus, Gekkonidae); és két gilisztafaj (Amynthas aspergillum, Megascolectidae és E. andrei, Lumbricidae). Ezeket a fajokat azért választották ki, mert ők vagy közeli hozzátartozóik szimpatikusak a R. pentasupralabialis-szal vagy a R. nuchalis csoport más tagjaival. A Lampyrid szentjánosbogár lárvák nem voltak használhatók ebben a tesztben. Desztillált vizet és kölnit (Shower Fresh, Ocean Citrus, Mandom; desztillált vízzel 10% -ra hígítva) használtunk kontrollként, vizet mint zsákmányszag oldószert és kölnit detektálható, de biológiailag lényegtelen szagként.

Nukleáris mágneses rezonancia (NMR) - spektroszkópiai elemzés.

Az NMR-spektrumokat Bruker AV-400 III spektrométerrel (400 MHz) mértük, belső standardként tetrametil-szilánt használva. Mindegyik mintát feloldottuk CD3OD-ban és 1H, 13 C, hidrogén – hidrogén korrelációs spektroszkópiában (HH COZY), heteronukleáris egykvantum korrelációban (HSQC), heteronukleáris többszörös kötés koherenciában (HMBC), valamint a nukleáris overhauser hatásban és cserepektroszkópiában ( NOESY) spektrumokat kaptunk. Az 1H-NMR adatait a következőképpen rögzítjük: kémiai eltolódás (δ, ppm), sokaság (s, szingulett, d, dublett; t, triplett; q, kvartett; m, multiplett; br, széles), integráció és kapcsolás állandó (Hz).

Adatok elérhetősége.

Minden adatot a fő szöveg és az alátámasztó információk tartalmaznak, kivéve a kígyók és szentjánosbogarak toxinjainak molekulatömegére vonatkozó adatokat, amelyek ésszerű kérésre rendelkezésre állnak a megfelelő szerzőtől.