A butiril-kolinészteráz géntranszfer elhízott egerekben megakadályozza a testtömeg visszapattanását azáltal, hogy elnyomja a ghrelin jelátvitelt

Keresse meg ezt a szerzőt a Google Tudósban
Keresse meg ezt a szerzőt a PubMed oldalon
Keresse meg ezt a szerzőt ezen a webhelyen
Levelezés céljából: chen.vicky @ mayo.edubrimijoin @ mayo.edu

Szerkesztette Jeffrey M. Zigman, a Texasi Egyetem Délnyugati Orvosi Központja, és David J. Mangelsdorf szerkesztőségi tag elfogadta 2017. augusztus 25-én (2017. április 19-én kapott felülvizsgálatra)

Jelentőség

Az elhízás a közegészségügy egyik fő problémája, amely befolyásolja a testi és érzelmi jólétet. Bár az életmódra épülő programok segíthetnek a fogyásban, a testsúly visszaszerzésének elkerülése a tartós hormonális alkalmazkodás miatt szinte lehetetlen. Itt egérmodellekben egy hatékonyabb stratégiát tártunk fel a butiril-kolin-észteráz (BChE) vírus géntranszferjének felhasználásával az étvágyközvetítő hormon acil-ghrelin szabályozására. Megállapítottuk, hogy a BChE vektor egyetlen injekciója egy életen át magas enzim expresszióhoz és alacsonyabb keringő acil-ghrelinhez vezetett. Ugyanez a kezelés elnyomta a posztdieting hyperphagia-t, korrigálta az anyagcsere elváltozásokat és csökkentette a súly visszanyerését. Ez az eredmény megerősíti a BChE-ghrelin tengely testtömegre gyakorolt hatását, és jelzi, hogy a BChE géntranszfer sikeres stratégia lehet az elhízás és a „metabolikus szindróma” hosszú távú ellenőrzésére.

Absztrakt

Az elhízás globális járványsá vált az obesogén környezeteknek köszönhetően, amelyekben bőséges a kalóriatartalmú étel, a passzív szórakozás a szokásos, és kevés a fizikai aktivitás. A világ felnőtt lakosságának több mint egyharmada túlsúlyos vagy elhízott, és a prevalencia folyamatosan növekszik (1). Számos krónikus betegséget és állapotot közvetlenül az elhízás okoz vagy elősegít, például diabetes mellitus, rák, szív- és érrendszeri betegségek, magas vérnyomás és osteoarthritis, amelyek csökkentik az életminőséget és a hosszú élettartamot (2). Sürgősen meg kell fordítani ezeket a tendenciákat az elhízás megelőzésével és kezelésével.

A kalória-korlátozás (CR) egy általános stratégia a testtömeg gyors csökkentésére, az anyagcsere javítására és a várható élettartam növelésére (3, 4). Az elhízott diéták többségének azonban hosszú távon nem sikerül fenntartania a csökkent súlyt, a testfeleslegük pedig szinte megoldhatatlan kihívást jelent (5). A fogyás után akut kompenzációs változások lépnek fel, amelyek között jelentősen csökken az energiafelhasználás és az étvágy mélyen megnő (6). Így az elhízás és a súlygyarapodás elleni küzdelem hasonlít a kábítószer-függőkre. Az elhízás visszaesésének elkerülése szempontjából kulcsfontosságú a hosszú távú fogyás akadályainak megértése.

A testtömeget a központi idegrendszer szabályozza, mivel a perifériás hormonális jelek beépülnek a hipotalamuszba, hogy szabályozzák az ételbevitelt és az energiamennyiséget (7). A fogyás után a testtömeget szabályozó hormonok bősége megváltozni kezd (8). Az acil-ghrelin az egyik kulcsfontosságú hormon, amely az anyagcsere-információkat továbbítja a perifériáról a központi rendszerekre. Ez a peptid főleg a gyomor-bél traktusból szabadul fel, de átjuthat a vér-agy gáton, hogy növekedési hormon szekretagóg receptorokon (GHSR1a) keresztül aktiválja az orexigén neuropeptid Y (NPY)/agouti-hoz kapcsolódó fehérje (AGRP) neuronokat (9, 10). Ez az „éhséghormon” nem sokkal étkezés előtt emelkedik, és utána esik (11). A táplálékfelvételre gyakorolt orexigén hatásának megfelelően a plazma-acil-ghrelin magas, ha az energiamérleg negatív, és alacsony, ha pozitív (12, 13). A legújabb tanulmányok azt sugallják, hogy a ghrelin receptor érzékenysége reagál a testtömegre is. Így az étrend által kiváltott súlygyarapodás központi ghrelin rezisztenciát okoz (14), míg a CR és a testsúlycsökkenés helyreállítja a receptor érzékenységét (15). Nemrégiben Zigman és mtsai. (16) felvetette azt az elképzelést, hogy az elhízás által kiváltott központi ghrelin rezisztencia megfordítható diéta okozta súlycsökkenéssel, és hogy a helyreállított receptor érzékenység lehet a fő tényező, amely a visszapattanó súlygyarapodást vezérli.

Nemrégiben beszámoltunk arról, hogy a butiril-kolinészteráz (BChE) enzim modulálja a ghrelin jelátvitelt azáltal, hogy hasítja a hormon n-oktanoil-csoportját, és az acil-ghrelint inaktív, vagy másképp aktív formájává, desacil-ghrelinré alakítja (17 ⇓ –19). A BChE szintetizálódik a májban és kiválasztódik a keringésbe, de az agyban is kifejeződik (20). Nagyszabású klinikai vizsgálatok azt találták, hogy a megváltozott szérum BChE korrelál az elhízással, a lipidek metabolizmusának zavarával, a 2-es típusú cukorbetegséggel és az emelkedett kardiovaszkuláris kockázatokkal (21 –23). Valószínű klinikai jelentősége ellenére kevés tanulmány vizsgálta a BChE és az elhízás közötti okozati összefüggéseket. Legfrissebb eredményeink szerint a BChE erősen befolyásolja a zsíranyagcserét és a testzsír felhalmozódását (24, 25). Itt feltételezzük, hogy a BChE az étrend okozta súlycsökkenés és a későbbi súlygyarapodás során szabályozza a testtömeget a ghrelin jelátvitel szabályozásával. Ennek a hipotézisnek a tesztelésére stratégiát alkalmaztunk a BChE vírusvektor-géntranszfer segítségével egerekben, diétás beavatkozásokkal. Jelen eredmények azt mutatják, hogy a BChE géntranszfer képes a plazma acil-ghrelin hosszú távú csökkenését elősegíteni, és ezáltal egészséges hatást gyakorolhat az ételbevitelre, a testtömegre és a glükóz homeosztázisra.

Anyagok és metódusok

Állatok és etika.

A hím C57BL/6 egereket a Jackson Labs-tól szereztük be az A53015 protokoll szerint, amelyet a Mayo Clinic intézményi állatgondozási és felhasználási bizottsága hagyott jóvá. A kísérleteket a Laboratóriumi állatok gondozásának és felhasználásának útmutatója (26) szerint hajtották végre az Amerikai Laboratóriumi Állatgondozás Akkreditációjának Szövetsége által jóváhagyott létesítményben. Nyolc hetes, kezdetben hasonló testtömegű egereket 12 hétig tartottak fenn ad libitum chow vagy magas zsírtartalmú étrenden (HFD) (10% vagy 45% zsír, Research Diets D12450H és D12451). Az egereket ezután egyketrecbe helyeztük, és folytattuk chow ad libitum (1. csoport), HFD ad libitum (2. csoport) vagy 40% -os CR-vel 3 hétig (3. és 4. csoport) való chow-t. A CR-csoportok a CR harmadik hetében chow-étrendet fogyasztottak, és a napi kalóriamennyiség 60% -át adta annak, amit az egyes egerek megettek az előző héten (40% CR). A kísérleti sémát az 1. ábra mutatja. Miután a CR véget ért, a chow-étrendet ad libitum adták, amíg a kísérlet befejeződött.

Kísérleti séma. Nyolc hetes C57BL/6 hím egereket négy 10-es csoportba osztottunk. A Chow és HFD kontroll egereket végig ad libitum-mal etettük. A CR + Luc és CR + BChE csoportokat 12 hét HFD-etetés után AAV-Luc vagy AAV-BChE-vel kezeltük, majd 3 hétig 40% CR-vel chow-ra váltottak, majd további 12 hétig ad libitum chow-val. A CR egerek számára biztosított napi kalóriamennyiség 60% -át adta annak, amit az egér megevett az előző héten a HFD etetés során. Időpontokat mutatunk be a legfontosabb kísérleti eljárásokhoz, beleértve a vírusinjekciót, a napi táplálékmérést, a glükóz tolerancia tesztet (GTT), az átfogó laboratóriumi állat-ellenőrzési rendszert (CLAMS) és az acil-ghrelin kihívást.

Intravénás injekció.

A luciferázt (Luc) vagy az egér BChE-t kódoló cDNS-t adeno-asszociált vírus (AAV) gerincbe szubklónoztuk. Az eredményül kapott vírustranszfer-vektorokat együtt transzfektáltuk HEK293T sejtekbe pHELP-vel (Applied Viromics) és pAAV 2/8 (Pennsylvaniai Egyetem) a korábban leírtak szerint (27). A sejtlizátumokban lévő vírust ultracentrifugálással izoláltuk, valós idejű PCR-rel történő kvantitatív meghatározás céljából. Vektorot (100 µL, 10 13 vírusrészecske farokvénán keresztül, 200 μl steril 0,9% NaCl-val öblítve) adtunk 20 hetes egereknek 12 hét HFD után.

Testösszetétel és energiaköltségek.

A zsírtömeget és a sovány tömeget testösszetétel-analizátorral (EchoMRI LLC) értékeltük. Az oxigénfogyasztást (VO2), a széndioxid-lejáratot (VCO2) és az energiafelhasználást közvetett kalorimetriával mértük egy átfogó laboratóriumi állatfigyelő rendszerben (Columbus Instruments), amely 12 órás fény mellett állandó környezeti hőmérsékletet (22 ° C) tartott. -h sötét ciklus. A spontán motoros aktivitást automatikusan rögzítettük és pontoztuk, amikor a teljes ambuláció egy 24 órás megfigyelési ablakban megszámlálódik.

Táplálékbevitel.

A táplálékfelvételt napi 2 héten keresztül határoztuk meg egyedileg tartott egerekben, az ágyneműt izopárnákkal helyettesítettük, hogy lehetővé tegyük a maradék étel minden szemcséjét. Minden nap új élelmiszer-pelletet biztosítottunk, és a maradékot 24 órával később megmértük.

Az Acyl-Ghrelin hatása a növekedési hormon felszabadulására.

Az egereket 1 órával a kísérlet előtt egy csendes és elszigetelt eljárási helyiségben helyeztük el. Ezután pentobarbitállal (50 mg/kg, i.p.) altattuk őket, és 10 perccel később i.p. humán acil-ghrelin (0,5 mg/kg; Phoenix Pharmaceuticals). A növekedési hormon vizsgálathoz vért gyűjtöttünk az acil-ghrelin injekció előtt és 3, 10 és 20 perccel azután.

Acil-Ghrelin hatása az étvágyra.

A vizsgálat előtt egy órával az egereket véletlenszerű sorrendben telepítettük le egy elszigetelt eljárási helyiségben. Egy korábbi eljárást (28) követően az egereknek sóoldatot adtak i.p. és hozzáférést biztosított az ételekhez. Az ételbevitelt 30 perccel később mértük. Tizenöt perccel később ugyanazok az egerek 0,5 mg/kg humán acil-ghrelint kaptak. A táplálékfelvételt az acil-ghrelin injekció beadása után 30 perckor és 60 percnél mértük, így az első 30 percet, a második 30 percet pedig.

Plazmaelemzés.

A vért (~ 0,2 ml) egér lancettel vettük egyarcú szúrással 9 és 10 óra között, és a vérzést steril gézzel állítottuk meg. A ghrelin mintákat lehűtött EDTA-val kezelt csövekbe gyűjtöttük 0,1 térfogat 1 M HCl-lel és proteáz-inhibitorokkal (1 mM p-hidroxi-mercuribenzoesav, Sigma-Aldrich; 1,5 μM aprotinin, Roche). A mintákat 10 percig centrifugáltuk 8000 x g-vel és -80 ° C-on tároltuk. ELISA készleteket használtak az inzulin (Alipco), az acil-ghrelin és a desacil-ghrelin (Cayman Chemical) szintjének mérésére, a vizsgálatok közötti variációs együtthatók 4,0%, 3,8% és 6,7% voltak. A BChE aktivitást Ellman-esszével határoztuk meg a korábban leírtak szerint (29).

Glükóz tolerancia teszt.

A hat órán át éheztetett egereknek (véletlenszerű sorrendben egyketrecben) 1,2 g/kg glükózt kaptak i.p. injekció. A vércukorszintet az injekció beadása előtt, majd 20, 40, 60, 90 és 120 perccel később ellenőriztük.

Génkifejezés.

A hipotalamust és az agyalapi mirigyet altatásban 50 mg/kg pentobarbitállal összegyűjtöttük és jéghideg sóoldattal perfundáltuk. Az összes RNS-t TRIzollal (Invitrogen) extraháltuk, és 1 μg alikvot részeket nagy kapacitású cDNS reverz transzkripciós készlettel (Applied Biosystems) dolgoztunk fel. A valós idejű PCR-t CFX384 detektáló rendszerrel (Bio-Rad) végeztük. A PrimeTime előre tervezett primerek (Integrated DNA Technologies) szekvenciái az S1 táblázatban találhatók.